Responsable : Stéphane Germain

Hypoxie, angiogenèse et intégrité vasculaire en pathologie cardiovasculaire et tumorale

1L’hypoxie, ou diminution de la pression partielle d’oxygène, est une caractéristique des tumeurs et des maladies cardiovasculaires ischémiques. Cette altération du microenvironnement hypoxique provoque une reprogrammation de l’expression de gènes codant pour des protéines impliquées dans la régulation de l’intégrité vasculaire et la reperfusion tissulaire. Notre recherche porte sur l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans l’hypoxie et l’angiogenèse en réponse à l’ischémie. Dans ce contexte, nous avons émis l’hypothèse que les gènes régulés par l’hypoxie peuvent constituer des marqueurs de diagnostic et/ou de cibles thérapeutiques de pathologies ischémiques et tumorales, où l’angiogenèse est modulée par l’hypoxie.

A. Pathologies ischémiques

217 millions de personnes meurent de maladies cardio-vasculaires, principalement d’infarctus du myocarde (AMI) et d’accident vasculaire cérébral (AVC), par an. La reperfusion est le traitement de choix pour limiter les atteintes tissulaires. Cependant, un endothélium endommagé ne permet pas une reperfusion optimale, on parle alors de no-reflow. Optimiser les stratégies thérapeutiques visant au maintien de l’intégrité vasculaire et à une reperfusion la plus efficace possible représente ainsi un enjeu médical important.

3Nous avons montré que la protéine angiopoietine-like 4 (ANGPTL4), sécrétée par les cellules endothéliales, est une cible majeure de l’hypoxie, et démontré son rôle dans la modulation de la perméabilité vasculaire au cours de l’infarctus du myocarde [1] et de l’AVC [2]. Mécanistiquement, ANGPTL4 module la signalisation VEGF/VEGFR2 en diminuant la phosphorylation de Src, conduisant ainsi à une stabilisation de jonctions entre cellules endothéliales. Nos études montrent donc qu’ANGPTL4 protège l’intégrité vasculaire après ischémie/reperfusion et représente une nouvelle cible thérapeutique. Ces recherches ont donné lieu au dépôt d’un brevet (PCT/EP2011/050682) et ont été poursuivies dans le cadre d’un projet financé par l’Agence nationale de la recherche. Le but de cette recherche est de valider cette preuve de concept de protection vasculaire au cours de l’infarctus du myocarde, dans des modèles précliniques pertinents pour la pathologie humaine (porc). Ces études sont menées en collaboration avec l’équipe 3 du l’institut Mondor de recherche biomédicale et l’École vétérinaire de Maisons-Alfort.

4En clinique (41 patients présentant un premier infarctus analysés dans les 12 h suivant les symptômes), nous avons étudié si les taux sériques d’ANGPTL4 sont associés à no-reflow après intervention coronarienne percutanée primaire. Le no-reflow a été évalué par imagerie cardiaque par résonance magnétique (IRM), la méthode de référence. Après analyse de régression logistique multivariée, les variables indépendamment associés au no-reflow sont : les taux sériques bas d’ANGPTL4 (odds ratio 0,82, IC à 95 % 0,70 à 0,98, P = 0,02), un pic élevé de troponine T (odds ratio 1,03, IC à 95 % 1,00-1,05, P = 0,03) et des niveaux plus élevés de protéine C réactive (odds ratio 1,18, IC 95 % 1,00 à 1,39, P = 0,05). Bien que basé sur une petite cohorte, nos travaux suggèrent que les taux d’ANGPTL4 sont associés au no-reflow et peuvent donc servir de test biologique alternatif à l’imagerie par résonance magnétique [3].

B. Identification de nouveaux régulateurs de l’angiogenèse

5L’analyse protéomique de la matrice extracellulaire de cellules endothéliales cultivées en normoxie ou hypoxie nous a permis d’identifier la lysyl oxidase like 2 (LOXL2) et la transglutaminase 2 (TG2).

I. La transglutaminase 2

6L’angiogenèse par bourgeonnement est stimulée par le facteur de croissance vasculaire endothélial dont l’isoforme majoritaire -VEGF165- est localisée dans la matrice extracellulaire (ECM) et se lie aux héparans sulfate protéoglycans (HSPG). La présentation du VEGF165 par les HSPG potentialise la signalisation par le récepteur de type 2 du VEGF (VEGFR2). La TG2 est à la fois une enzyme de transamidation et une protéine de la matrice impliquée dans les interactions cellule-matrice. Nous avons étudié l’effet de la TG2, qui se lie aux HSPG, sur i) l’interaction entre le VEGF 165 avec les HS et ii) l’angiogenèse. L’angiogenèse est accélérée chez les souris déficientes en TG2 (KO) i) dans la rétine au cours du développement et ii) dans des implants de matrigel. De plus, le bourgeonnement des capillaires endothéliaux en réponse VEGF 165 est aussi augmenté in vitro lorsque les cellules sont déficientes en TG2.

7Mécanistiquement, nos études montrent que de la migration des cellules endothéliales est simulée par l’absence de TG2, associée à une augmentation de la phosphorylation de la Tyr951 du VEGFR2 et de ses cibles Src et Akt. Au contraire, l’invaliation de TG2 n’affecte pas la phosphorylation de la Tyr1175 du VEGFR2, ni la prolifération cellulaire.

8Nos études de résonance plasmonique de surface ont montré que TG2 entre en compétition avec le VEGF pour son interaction avec les HS. Ces résultats montrent donc que les complexes VEGF165-HSPG pourraient être ciblés pharmacologiquement afin de moduler l’angiogenèse au cours du développement et en thérapeutique. Ces résultats viennent d’être publiés dans Science Signaling et d’en faire la couverture [4].

II. La LOXL2

9La LOXL2 appartient à la famille des lysyl oxidases qui sont des enzymes sécrétées responsables du pontage covalent de constituants matriciels (collagène et élastine). Elles participent aux processus morphogénétiques au cours du développement et à la réparation tissulaire. Notre équipe a démontré que la lysyl oxidase like-2 (LOXL2) est sécrétée par les cellules endothéliales en condition hypoxique et régule l’angiogenèse développementale par un mécanisme indépendant de son activité catalytique [5]. Au contraire, l’inhibition de l’activité catalytique de la protéine extracellulaire empêche le développement d’un microenvironnement pathologique, dans les fibroses du foie et du poumon.

10A - Nos travaux portent actuellement tout d’abord sur la caractérisation de l’impact de LOXL2 sur la formation d’hydrogels de collagène et sur l’angiogenèse dans des modèles d’angiogenèse in vitro en 3-D. Ces travaux pluridisciplinaires, financés par le programme Émergence de l’UPMC, sont menés avec le groupe de Thibaud Coradin dans le LCMCP (laboratoire de Chimie de la matière condensée de Paris) au Collège de France. Cette étude a permis d’obtenir une gamme d’hydrogels de collagène ayant des propriétés de rigidité et de structure spécifiques, en faisant varier 3 paramètres de polymérisation : le pH, la température et la concentration. Nous avons montré que LOXL2 est capable de renforcer la rigidité de ces matériaux et de modifier leurs structures. En ce qui concerne l’angiogenèse, nous avons identifié les facteurs de rigidité et de porosité importants pour la formation de capillaires. L’étude de l’impact de LOXL2 sur la formation de capillaires dans ces gels se poursuit et constitue la dernière étape pour publication de cette étude.

11B - Nous poursuivons l’étude de la régulation de l’angiogenèse par la LOXL2 par l’analyse de i) la fonction autonome cellulaire de LOXL2 endothéliale in vitro dans des modèles cellulaires en 3D et in vivo au cours du développement du zebrafish ; ii) la fonction non autonome cellulaire de LOXL2 extracellulaire microenvironnementale (protéine recombinante LOXL2 purifiée au laboratoire) et iii) la LOXL2 des fibroblastes activés (cancer-associated fibroblasts, CAF) isolés à partir de biopsies de cancers du rein.

12L’ensemble de ces travaux permettra de caractériser l’action de protéines matricielles régulées par l’hypoxie, contribuant aux modifications du microenvironnement et impliquées dans les processus angiogéniques.

Références

13[1] Galaup A., Circulation, 125, 2012, 140-9 ; [2] Bouleti C., Eur Heart J, 34, 2013, 3657-68 ; [3] Bouleti C., International journal of cardiology, 187, 2015, 511-6 ; [4] Beckouche N., Sci Signal, 8, 2015, ra70. ; [5] Bignon M., Blood, 118, 2011, 3979-89.

Publications (septembre 2014 – août 2015)

14Beckouche N., Bignon M., Lelarge V., Mathivet T., Pichol-Thievend C., Berndt S., Hardouin J., Garand M., Ardidie-Robouant C., Barret A., Melino G., Lortat-Jacob H., Muller L., Monnot C. et Germain S., « The interaction of heparan sulfate proteoglycans with endothelial transglutaminase-2 limits VEGF165-induced angiogenesis », Science Signaling, 8(385), 2015, ra70, DOI : 10.1126/scisignal.aaa0963.

Besnier M., Galaup A., Nicol L., Henry J.-P., Coquerel D., Gueret A., Mulder P., Brakenhielm E., Thuillez C., Germain S., Richard V. et Ouvrard-Pascaud A., « Enhanced angiogenesis and increased cardiac perfusion after myocardial infarction in protein tyrosine phosphatase 1B-deficient mice », FASEB journal, 28(8), août 2014, 3351-3361, DOI : 10.1096/fj.13-245753.

Bouleti C., Mathivet T., Lapergue B., Monnot C. et Germain S., « [Protection of vascular integrity in reperfusion during stroke] », Médecine Sciences, 30(6-7), juillet 2014, 608-610, DOI : 10.1051/medsci/20143006003.

Bouleti C., Mathivet T., Serfaty J.-M., Vignolles N., Berland E., Monnot C., Cluzel P., Steg P.G., Montalescot G. et Germain S., « Angiopoietin-like 4 serum levels on admission for acute myocardial infarction are associated with no-reflow », International Journal of Cardiology, 187, mars 2015, 511-516, DOI : 10.1016/j.ijcard.2015.03.263.

Gauvrit S., Philippe J., Lesage M., Tjwa M., Godin I. et Germain S., « The role of RNA interference in the developmental separation of blood and lymphatic vasculature », Vascular cell, 6(1), 2014, 9, DOI : 10.1186/2045-824X-6-9.

Le Gal L., Alonso F., Wagner C., Germain S., Nardelli Haefliger D., Meda P. et Haefliger J.-A., « Restoration of connexin 40 (cx40) in Renin-producing cells reduces the hypertension of cx40 null mice », Hypertension, 63(6), juin 2014, 1198-1204, DOI : 10.1161/HYPERTENSIONAHA.113.02976.

Varna M., Gapihan G., Feugeas J.-P., Ratajczak P., Tan S., Ferreira I., Leboeuf C., Setterblad N., Duval A., Verine J., Germain S., Mongiat-Artus P., Janin A. et Bousquet G., « Stem cells increase in numbers in perinecrotic areas in human renal cancer », Clinical Cancer Research, 21(4), février 2015, 916-924, DOI : 10.1158/1078-0432.CCR-14-0666.