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111 | 2012
Annuaire du Collège de France 2010-2011
Résumé des cours et travaux 111e année
Équipes accueillies

Régulation moléculaire de la synaptogenèse chez la souris

CIRB UMR7241 - U1050
Fekrije Selimi
p. 937-941

Texte intégral


   

Responsable : Fekrije Selimi

Recherche

  • 1  Zoghbi H.Y., Science (New York), N.Y 302 (5646), 2003, 826.
  • 2  Frankle W.G., Lerma J. et Laruelle M., Neuron, 39(2), 2003, 205.
  • 3  Jamain S., Quach H., Betancur C. et al., Nature genetics, 34(1), 2003, 27.

1Les dysfonctionnements caractéristiques des patients atteints par des maladies neuropsychiatriques telles la schizophrénie, l’autisme ou le syndrome de Rett ne sont pas dus à des pertes massives de neurones, mais à un mauvais fonctionnement de leurs circuits neuronaux1. Les patients atteints de schizophrénie présentent des défauts de transmission synaptique, des activations de circuits aberrantes et une diminution de la densité des épines dendritiques, sites de la formation de synapses2. Par ailleurs, une analyse de patients autistiques a identifié des mutations dans les gènes codant neuroligin-3 et neuroligin-43. Les neuroligins sont des protéines localisées au niveau des synapses et semblent être impliquées dans leur formation, ce qui pointe à nouveau vers un problème au niveau des connexions neuronales dans l’autisme. Il semblerait donc que ces maladies neuropsychiatriques soient des conséquences d’un déficit de formation ou de raffinement des connexions neuronales.

2Le bon fonctionnement du cerveau adulte nécessite la formation et le maintien de synapses fonctionnelles et spécifiques entre des types de neurones très variés. Dans le système olivo-cérébelleux, la cellule de Purkinje (CP) reçoit principalement deux afférences excitatrices : l’une provient des grains via les fibres parallèles (FP) et l’autre provient des neurones olivaires via les fibres grimpantes (FG). La CP reçoit également deux types d’afférences inhibitrices : l’une des cellules étoilées et l’autre des cellules en panier. Chacune de ces synapses est localisée sur des territoires séparés de la CP. Le système olivo-cérébelleux peut être étudié à la fois au niveau morphologique, électrophysiologique et comportemental. Il est donc un système d’étude idéal pour analyser les mécanismes moléculaires menant à l’établissement de réseaux neuronaux fonctionnels.

  • 4  Sperry R.W., « Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America », (...)

3La formation de synapses spécifiques est régulée grâce à des protéines spécifiques de reconnaissance, qui formeraient un « code synaptique », dont la composition précise reste encore inconnue4. Notre projet est de caractériser ce code synaptique pour chaque type de synapses localisées sur la cellule de Purkinje afin de mettre en évidence les mécanismes permettant la formation de synapses spécifiques.

Synapse fibre parallèle/cellule de Purkinje (FP/CP) : nouvelles voies de signalisation

Mise en place de la stratégie Syprot

  • 5  Gong S., Zheng C., Doughty M.L. et al., Nature, 425 (6961), 2003, 917.

4Nous avons mis au point une nouvelle approche permettant l’identification des protéines présentes spécifiquement à une synapse donnée dans un type neuronal précis : la stratégie Syprot. Cette approche combine les techniques de transgenèse et de biochimie et l’analyse par spectrométrie de masse. Brièvement, nous produisons des souris transgéniques exprimant des récepteurs spécifiques de certaines synapses fusionnés à la protéine fluorescente verte (GFP). Ces récepteurs sont exprimés dans un type neuronal précis dans les souris transgéniques grâce à la technique de modification des chromosomes artificiels de bactérie fortement développée dans le laboratoire du Pr. Heintz5. Un anticorps anti-GFP est ensuite utilisé pour immunopurifier les densités post-synaptiques contenant ces récepteurs taggés. Une étude par spectrométrie de masse nous permet d’analyser la composition protéique de ces synapses spécifiques.

  • 6  Selimi F., Cristea I.M., Heller E. et al., PLoS Biol., 7(4), 2009, e83.

5Une première étude a permis l’identification d’environ 60 protéines localisées spécifiquement à la synapse fibre parallèle/cellule de Purkinje (FP/CP). Les résultats obtenus confirment la diversité des protéines pouvant participer au « code synaptique » définissant la synapse FP/CP. Par ailleurs, de nombreuses protéines liées au métabolisme des phospholipides ont été mises en évidence par cette analyse, dont certaines ont fait l’objet d’études fonctionnelles6.

Étude d’une nouvelle voie de signalisation synaptique : les récepteurs BAI3

  • 7  Shiratsuchi T., Nishimori H., Ichise H. et al., Cytogenetics and cell genetics, 79(1-2), 1997, 103
  • 8  Adams J.C. et Tucker R.P., Dev. Dyn., 218(2), 2000, 280.

6Notre étude a montré la localisation à la synapse FP/CP d’une nouvelle classe de récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs BAI (Brain Angiogenesis Inhibitor7). Ces récepteurs sont des candidats potentiels comme molécules de reconnaissance pour la formation de la synapse FP/CP, puisque leur domaine extracellulaire contient des répétitions thrombospondines, domaine présent dans de nombreuses molécules d’adhésion8. Ces récepteurs ont très peu été étudiés dans le système nerveux central, malgré leur fort taux d’expression dans ce tissu.

  • 9  Zhang H., Webb D.J., Asmussen H. et al., J. Neurosci., 25 (13), 2005, 3379.

7Nous réalisons des travaux de biochimie et d’immunocytochimie sur cellules transfectées pour disséquer la voie de signalisation de BAI3, en particulier sa capacité à activer Rac1, un régulateur important du cytosquelette d’actine au niveau des synapses9. Grâce à des transfections de neurones d’hippocampe en culture, nous avons pu montrer un rôle de BAI3 dans la morphogenèse dendritique.

  • 10  Ichikawa R., Miyazaki T., Kano M. et al., J. Neurosci., 22 (19), 2002, 8487.

8Afin d’étudier le rôle des récepteurs BAI3 in vivo, en particulier à la synapse FP/CP, plusieurs lignées de souris transgéniques ont été générées: l’une d’elles exprime la protéine BAI3 fusionnée à un marqueur fluorescent spécifiquement dans les cellules de Purkinje grâce au promoteur L7/pcp2 (figure 1). Deux autres lignées expriment des formes « dominantes-négatives » qui permettront de perturber la voie de signalisation de BAI3 in vivo. Une analyse par immunofluorescence a montré que ces différentes lignées expriment bien les transgènes correspondants (figure 2). L’analyse quantitative de l’arborisation des CPs (en collaboration avec le Dr. Isope, UMR7168, Strasbourg) ne montre pas de modification liée à l’expression des transgènes (données non publiées). Au niveau synaptique, nos travaux montrent une extension distale de l’innervation par les FGs des cellules de Purkinje exprimant la construction BAI3-FLT, ce qui pourrait être indicatif d’un déficit de signalisation au niveau des synapses FP/CP10 (données non publiées).

Figure 1 : Représentation schématique du récepteur BAI3 sauvage (WT) et des formes fusionnées à la GFP

Figure 1 : Représentation schématique du récepteur BAI3 sauvage (WT) et des formes fusionnées à la GFP

CUB : interaction domain
TSP1 : thrombospondin repeats (domaine d’adhésion)
QTEV : PDZ binding domain
Cercle vert : Green Fluorescent protein

Figure 2

Figure 2

Les constructions BAI3-SCT (A, C) et BAI3-FLT (B, D) sont exprimées spécifiquement dans les cellules de Purkinje de souris transgéniques à P10 (C, D) et chez l’adulte (A, B) (immunofluorescence anti-GFP) (données non publiées).

Étude de la synapse fibre grimpante/Cellule de Purkinje (FG/CP)

9Les cellules de Purkinje (CPs) reçoivent deux types d’afférences excitatrices, l’une des cellules en grains via les fibres parallèles (FP/CP), et l’autre des neurones olivaires (IONs), via les fibres grimpantes (FG/CP). Ces deux synapses excitatrices sont clairement différentes au niveau physiologique, mais aussi au niveau de leur localisation subcellulaire. Notre but est d’appliquer la stratégie SYPROT à l’étude de la synapse FG/CP, pour identifier sa composition protéique et la comparer à celle de la synapse FP/CP déjà identifiée6. Cette comparaison nous permettra de répondre à une question essentielle : quelles sont les différences moléculaires entre deux types de synapses excitatrices établies sur le même neurone-cible et donc qui sous-tendent la spécificité synaptique ?

10Pour appliquer la stratégie SYPROT aux synapses FG/CP, nous avons besoin d’identifier une protéine localisée spécifiquement à cette synapse, et absente des synapses fibres parallèles/cellule de Purkinje. Ce type de protéines est jusqu’à présent inconnu.

  • 11  Heiman M., Schaefer A., Gong S. et al., Cell 135 (4), 2008, 738.
  • 12  Doyle J.P., Dougherty J.D., Heiman M. et al., Cell 135 (4), 2008, 749.

11Nous proposons d’identifier des couples ligand/récepteur spécifiques de la synapse FG/CP en comparant le transcriptôme de chaque partenaire dans ce réseau neuronal (cellules de Purkinje versus cellules en grains versus neurones de l’olive inférieure) grâce à la technique du bacTRAP récemment développée dans le laboratoire de Nathaniel Heintz (Rockefeller University, USA)11. La stratégie du bacTRAP a été utilisée pour l’étude du transcriptôme d’environ 30 populations neuronales différentes, y compris les cellules de Purkinje et les cellules en grains12. Il ne nous reste donc qu’à identifier le transcriptôme du dernier partenaire du réseau : les neurones de l’olive inférieure.

12Nous avons utilisé deux modèles de souris bacTRAP : l’un provenant du laboratoire du Pr. Heintz, l’autre plus spécifique des neurones olivaires généré par notre équipe (figure 3). En comparant les données obtenues sur le transcriptôme des neurones olivaires avec celles obtenues par le groupe de Nathaniel Heintz sur le transcriptôme des cellules de Purkinje12, nous identifions des couples ligand/récepteur probablement localisés à la synapse FG/CP. Une seconde comparaison du transcriptôme des IONs avec celui des cellules en grains12 nous permet ensuite d’exclure les couples ligand/récepteur communs aux deux synapses et de sélectionner ceux qui sont spécifiques des synapses fibre grimpante/cellule de Purkinje. Les caractéristiques des candidats avec un bon potentiel comme marqueur des synapses fibre grimpante/cellule de Purkinje sont les suivantes : forte expression dans les IONs, pas d’expression dans les cellules en grains (= spécificité potentielle pour les synapses FG/CP), présence de domaines transmembranaires. Nous sélectionnerons l’une des protéines identifiées comme marqueur pour appliquer la stratégie SYPROT à la synapse fibre grimpante/cellule de Purkinje.

Figure 3

Figure 3

(A) Des souris transgéniques exprimant des ribosomes-GFP dans les IONs (rectangle) ont été utilisées pour des expériences de bacTRAP. La souris générée par notre équipe avec le bac #2 est beaucoup plus spécifique. (B) La plupart des sondes correspondant à des gènes dont l’expression dans les IONs est connue (ex : Htr5b) se retrouvent parmi les candidats enrichis (gènes sous la diagonale basse) lorsqu’on les compare à la fraction non immunoprécipitée (polysomes non marqués). On remarque un enrichissement plus important des gènes spécifiques en utilisant une lignée transgénique plus spécifique.

Publications

13Selimi F., Cristea I.M., Heller E., Chait B.T. et Heintz N., « Proteomic studies of a single CNS synapse type: specific regulatory components of the parallel fiber/Purkinje cell synapse », PloS Biology, 7(4), 2009, e83.

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Notes

1  Zoghbi H.Y., Science (New York), N.Y 302 (5646), 2003, 826.

2  Frankle W.G., Lerma J. et Laruelle M., Neuron, 39(2), 2003, 205.

3  Jamain S., Quach H., Betancur C. et al., Nature genetics, 34(1), 2003, 27.

4  Sperry R.W., « Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America », 50, 1963, 703.

5  Gong S., Zheng C., Doughty M.L. et al., Nature, 425 (6961), 2003, 917.

6  Selimi F., Cristea I.M., Heller E. et al., PLoS Biol., 7(4), 2009, e83.

7  Shiratsuchi T., Nishimori H., Ichise H. et al., Cytogenetics and cell genetics, 79(1-2), 1997, 103.

8  Adams J.C. et Tucker R.P., Dev. Dyn., 218(2), 2000, 280.

9  Zhang H., Webb D.J., Asmussen H. et al., J. Neurosci., 25 (13), 2005, 3379.

10  Ichikawa R., Miyazaki T., Kano M. et al., J. Neurosci., 22 (19), 2002, 8487.

11  Heiman M., Schaefer A., Gong S. et al., Cell 135 (4), 2008, 738.

12  Doyle J.P., Dougherty J.D., Heiman M. et al., Cell 135 (4), 2008, 749.

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Table des illustrations

Titre Figure 1 : Représentation schématique du récepteur BAI3 sauvage (WT) et des formes fusionnées à la GFP
Légende CUB : interaction domainTSP1 : thrombospondin repeats (domaine d’adhésion)QTEV : PDZ binding domainCercle vert : Green Fluorescent protein
URL http://journals.openedition.org/annuaire-cdf/docannexe/image/1749/img-1.png
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Titre Figure 2
Légende Les constructions BAI3-SCT (A, C) et BAI3-FLT (B, D) sont exprimées spécifiquement dans les cellules de Purkinje de souris transgéniques à P10 (C, D) et chez l’adulte (A, B) (immunofluorescence anti-GFP) (données non publiées).
URL http://journals.openedition.org/annuaire-cdf/docannexe/image/1749/img-2.png
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Titre Figure 3
Légende (A) Des souris transgéniques exprimant des ribosomes-GFP dans les IONs (rectangle) ont été utilisées pour des expériences de bacTRAP. La souris générée par notre équipe avec le bac #2 est beaucoup plus spécifique. (B) La plupart des sondes correspondant à des gènes dont l’expression dans les IONs est connue (ex : Htr5b) se retrouvent parmi les candidats enrichis (gènes sous la diagonale basse) lorsqu’on les compare à la fraction non immunoprécipitée (polysomes non marqués). On remarque un enrichissement plus important des gènes spécifiques en utilisant une lignée transgénique plus spécifique.
URL http://journals.openedition.org/annuaire-cdf/docannexe/image/1749/img-3.png
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Pour citer cet article

Référence papier

Cours et travaux du Collège de France. Annuaire 111e année, Collège de France, Paris, avril 2012, p. 937-941. ISBN 978-2-7226-0156-7

Référence électronique

Fekrije Selimi, « Régulation moléculaire de la synaptogenèse chez la souris », L’annuaire du Collège de France [En ligne], 111 | 2012, mis en ligne le 22 novembre 2013, consulté le 26 avril 2018. URL : http://journals.openedition.org/annuaire-cdf/1749

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Auteur

Fekrije Selimi

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Droits d’auteur

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