1À la différence des études menées dans les pays en voie de développement (Jenner et al. 1987 ; Flinn 1999) sur les conséquences hormonales du stress psychosocial généré par le sport, les conditions de travail, les contextes scolaires et/ou d’orphelinat, les études menées dans les pays occidentaux sont généralement réalisées en laboratoire ou dans un lieu regroupant l’ensemble des sujets testés (Gardner 1971 ; Linder et al. 1990 ; Levine et al. 1994 ; de Bellis et al. 1999). Quand ce n’est pas le cas (Jenner et al. 1987 ; Long et al. 1993 ; Lupien et al. 2000), ces études ne concernent essentiellement que des adultes (Harrison et al. 1980 ; Harrison 1982 ; Jenner et al. 1982 ; James, Brown 1997). La question se pose donc de définir la meilleure méthodologie à appliquer pour traiter de cette question chez des enfants vivant en milieu urbanisé occidental.
2Deux catégories d’indicateurs biologiques révèlent de façon complémentaire des phases différentes du stress. Au cours de la phase précoce, les catécholamines (adrénaline et noradrénaline) participent à un système d’alerte dont la réponse est rapide mais fugace. Au cours de la phase de résistance de l’organisme, la réponse retardée mais durable des glucocorticoïdes témoigne de la mise en jeu de capacités adaptatives de l’organisme (Lôo et al. 1999).
3Dans ce travail, nous nous proposons de mesurer, chez des enfants et à leur domicile, ces divers indicateurs des tensions hormonales ou psychiques dues au stress (Selye 1956) et nous discuterons les meilleures conditions méthodologiques à réunir pour les observer.
4L’étude porte sur un sous-échantillon de 40 enfants d’origine sénégalaise, âgés de 5 à 15 ans, habitant des quartiers défavorisés du centre ou du nord de Marseille. Ils participent à une étude sur le stress ayant comme origine les contextes migratoire et familial. Ils sont tous nés en France et vivent auprès de leurs deux parents. L’étude a été réalisée sous la responsabilité de la mère au domicile même des sujets et s’est déroulée de février à avril 2001, pendant les vacances scolaires ou les jours de congé. Toutes les familles enquêtées ont fait acte de volontariat sous forme d’une autorisation du chef de famille dûment signée. Le projet avait été soumis au Comité d’éthique de l’Université de Marseille qui a émis un avis favorable.
5Dans la mesure où l’étude porte sur des sujets sains et ne génère aucun bénéfice individuel direct, le recueil des échantillons biologiques servant au dosage ne doit pas être invasif. C’est pourquoi nous avons exclu les prélèvements sanguins, qu’ils soient veineux ou capillaires. Comme les indicateurs biologiques de stress sont aussi dosables dans l’urine et dans la salive, il nous a semblé préférable d’opter pour l’un de ces deux substrats.
6Le problème de la conservation des urines au cours du nycthémère est souvent passé sous silence dans les publications. C’est pourtant un sujet important, particulièrement pour le dosage des catécholamines, hormones très sensibles à la lumière et à la chaleur. Leur recueil doit impérativement se faire dans un bocal opaque. De plus, elles sont instables à température ambiante et à pH neutre ou alcalin mais très stables en milieu acide (Miki, Sudo 1998). Aussi, en milieu hospitalier, les urines sont-elles recueillies dans un bocal contenant de l’acide chlorhydrique très concentré (6N en général) ou du métabisulfite de sodium comme le préconisent les auteurs anglo-saxons (Jenner et al. 1987). Ces techniques de conservation ne sont pas adaptées aux enquêtes à domicile, en raison de la dangerosité des conservateurs employés, particulièrement lorsque l’enquête porte sur des enfants. De plus, il est exclu que ces derniers urinent directement dans un bocal contenant ces conservateurs, celui-ci devant être impérativement placé hors de leur portée. Nous avons donc conservé les urines pendant les 24 heures que dure le recueil à une température de 4°C, le bocal opaque étant replacé au réfrigérateur après chaque miction. Selon Miki et Sudo (Miki, Sudo 1998), lorsque l’urine est stockée à 4°C et que le pH est neutre (cas d’urines non acidifiées), les catécholamines sont stables durant trois jours, le cortisol et la créatinine durant une semaine. Dans notre enquête, sur huit recueils, l’écart de mesures observé sur deux parts égales d’un même échantillon, une fraction étant conservée dans un pot opaque contenant 5 ml d’acide chlorhydrique 6N (méthode classique), l’autre dans un pot opaque contenant 5 ml d’eau distillée, est toujours resté en deçà de 5 %.
7La réalisation de cette enquête a été précédée d’un travail de sensibilisation auprès des familles, en particulier à propos du recueil des urines. Le plus difficile à faire admettre n’a pas tant été le recueil de l’urine, considérée comme un produit souillé, que sa conservation dans le réfrigérateur familial, à côté de denrées alimentaires, particulièrement dans les familles ayant un faible niveau d’études, immigrées depuis peu. Cependant, plusieurs vérifications ont permis de garantir que les consignes données aux familles ont été correctement respectées. Bien que l’on ne puisse éliminer tout risque d’erreurs, celles-ci devraient davantage affecter le dosage des catécholamines, à cause de leur grande instabilité, que celui du cortisol qui reste stable durant 24 h même à température ambiante (Miki, Sudo 1998).
8Nous avons relevé la diurèse du nycthémère et dosé les taux de créatinine, d’adrénaline, noradrénaline, dopamine et de cortisol. Nous n’avons pas sélectionné les dosages d’acide vanylmandélique, des 17-cétostéroïdes et de 17-hydroxycorticostéroïdes (Darlu, Boussin 1978) qui n’apparaissent pas dans la littérature récente.
9Pour quantifier séparément les taux d’adrénaline, noradrénaline et dopamine, nous avons procédé par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC). Cette méthode a l’avantage d’être plus spécifique que les autres méthodes, colorimétriques notamment (Schleicher et al. 1983). L’HPLC présente cependant un certain nombre d’inconvénients : elle nécessite une extraction préalable dont la procédure est complexe ; la chromatographie en elle-même est longue et demande environ 20 mn par dosage et s’avère onéreuse. Le dosage des catécholamines urinaires reste donc une entreprise assez fastidieuse et coûteuse, pour un résultat peu satisfaisant dans le cadre d’une enquête de longue durée portant sur un stress de nature psychosociale et incluant de nombreux échantillons.
10Le dosage du cortisol urinaire est effectué en radioimmunologie par compétition. Cette méthode présente l’avantage d’être fiable, spécifique, peu coûteuse et de ne pas être lourde à mettre en oeuvre.
11Notre échantillon comprenait un seul individu considéré comme pathologique, le sujet T2, atteint de la maladie de Recklinghausen. Nous l’avons éliminé des tests statistiques, bien qu’il ait été inclus dans le protocole afin de ne pas le discriminer par rapport aux autres enfants. Pour des raisons pratiques, un autre enfant (sujet X2) n’a été testé que sur le cortisol, ce qui porte l’effectif des dosages de catécholamines à 39.
12Les catécholamines sont le plus souvent exprimées en nanomoles par millimole de créatinine (Gourmelen, Perelman 1994 ; Miki, Sudo 1998), la créatinine urinaire étant mesurée par la méthode de Jaffé (Roche diagnostics, 1999). Les taux de cortisol, autrefois exprimés en nanomoles par litre d’urine sont, actuellement, exprimés en nanomoles par 24 heures, parfois en microgrammes par jour (Gomez et al. 1991), ce qui permet d’éliminer le facteur relatif à la dilution urinaire.
13La normalité des distributions des catécholamines, exprimées en nanomoles par millimole de créatinine, et du cortisol, exprimé en nanomoles/jour (fig. 1a) a été testée avant et après transformation logarithmique (fig. 1b).
14Alors que l’asymétrie des distributions est significative pour les mesures urinaires de cortisol (test de Cox, P < 0.05), d’adrénaline (P < 0.001), de noradrénaline (P < 0.01), et de dopamine (P < 0.05), la transformation logarithmique réduit l’asymétrie de manière statistiquement satisfaisante (P > 0.05) sauf pour l’adrénaline où l’asymétrie est seulement atténuée (P = 0.05). Par ailleurs, les valeurs aberrantes égales ou supérieures à m + 3 écarts types ont été éliminées. Ces valeurs marginales ne semblent pas avoir des causes cliniques mais résulter plutôt d’aléas méthodologiques. Ces aléas peuvent provenir de la grande sensibilité des catécholamines aux conditions de prélèvement, en particulier à la température et au pH. Nous pensons que le comportement des mères vis-à-vis des consignes dispensées – placer le plus rapidement possible le prélèvement au réfrigérateur – ainsi que les contraintes de terrain ne permettant pas, pour des raisons de sécurité, de stabiliser les réactions par de l’acide très concentré ou du métabisulfite de sodium, ont pu influencer la dégradation des catécholamines. Dans ce cas, on peut supposer que les urines les plus acides se sont les mieux conservées. Relever le pH de l’urine à la fin des recueils apporterait probablement un nouvel éclairage sur ce point.
Fig. 1 - Distribution du cortisol urinaire de 24 heures (nanomoles/jour), de l'adrénaline, noradrénaline et dopamine urinaire (nanommoles/mmole de créatinine) chez 40 enfants sénégalais nés à Marseille. 1a : valeurs absolues ; 1b : valeurs logarithmiques (base 10).
Fig. 1—Distribution of 24-hour urinary cortisol (nanomoles/day), adrenaline, noradrenaline and dopamine (nanomoles/mmole of creatine) in 40 Senegalese children born in Marseilles. 1a: absolute values; 1b: logarithmic values.
15Après transformation logarithmique, le cortisol, l’adrénaline, la noradrénaline et la dopamine, ne présentent plus de valeurs aberrantes, par excès ou par défaut. Seule une valeur du logarithme du rapport dopamine/créatinine (sujet B3) dépasse la limite supérieure fixée à 3,00. Comme les valeurs extrêmes ne concernent pas les mêmes sujets suivant les variables, nous n’avons pas supprimé les sujets mais seulement les valeurs aberrantes dans le traitement des résultats.
16Les valeurs moyennes et les erreurs standard des variables mesurées dans notre échantillon figurent au tableau I séparément pour les garçons et les filles. Nous devons signaler que des valeurs de référence chez l’enfant manquent dans la littérature, alors qu’elles sont connues chez l’adulte, si bien que chaque laboratoire utilise le plus souvent ses propres normes. Les tests non paramétriques U de Mann et Whitney sur les données brutes et les tests t de Student sur les données normalisées montrent que ni les âges, ni les mensurations anthropométriques, ni les dosages hormonaux ne diffèrent selon les sexes, y compris pour la dopamine si l’on écarte une valeur particulièrement élevée chez un garçon.
Tabl. I - Comparaison entre les variables anthropométriques et physiologiques des garçons (G) et des filles (F).
Effectif : n ; moyenne : m ; erreur standard : SE ; Indice de Masse Corporelle (ou BMI ou : indice de Quételet) : IMC = Poids/Stature 2 ; Surface corporelle appliquée aux 5-20 ans : SC = 0,03050 x Stature 0,35129 x Poids 0,54375 (Gehan, George 1970). Différences entre moyennes des garçons et des filles non significatives (P > 0.05, test U de Mann et Whitney sur les données brutes et test t de Student sur les données normalisées).
Table I—Comparison of anthropological and physiological measurements between boys (G) and girls (F).
Sample size: n; mean: m; standard error: SE; Body mass index (or BMI or Quételet’s index): IMC = Weight/Stature 2; Body area applied to 5-20 years: SC = 0,03050 x Stature 0,35129 x Weight 0,54375 (Gehan,George 1970). Differences between the averages for boys and girls are not significant (P > 0,05, Mann & Whitney U test on raw data and Student t-test on normalized data).
17Comme on peut l’imaginer, les dosages hormonaux évoluent avec l’âge, conjointement avec le format du corps chez l’enfant en croissance. De fait, les corrélations entre l’âge et les dosages urinaires de cortisol, noradrénaline et dopamine sont significatives (tabl. II, fig. 2). Elles ont été calculées, après avoir vérifié la linéarité des régressions avec l’âge (les régressions de degré supérieur sont non significatives, P > 0.29) et après avoir constaté que les pentes des droites de régression n’étaient pas significativement différentes chez les garçons et chez les filles (P > 0.60 ; P = 0.05 pour l’adrénaline). Dans la suite des analyses, les échantillons de garçons et de filles n’ont donc pas été distingués.
18Les catécholamines, fortement corrélées à l’âge, restent corrélées à cette variable même lorsqu’elles sont exprimées par unité de poids, de stature, d’indice de masse corporelle (IMC) ou de surface corporelle (SC), à la différence du cortisol qui, une fois rapporté au poids, à la surface corporelle ou à l’IMC ne présente plus de corrélation significative avec l’âge. Sa corrélation la plus faible avec l’âge est obtenue quand elle est exprimée par rapport à la surface corporelle ou à l’IMC.
Fig. 2 - Régressions des valeurs normalisées de cortisol (nanomoles/jour), adrénaline, noradrénaline et dopamine urinaire (nanommoles/mmole de créatinine) en fonction de l’âge, chez les garçons et les filles. Les équations de régressions sont données pour l’ensemble de l’échantillon.
Fig. 2—Regression of the normalized values of urinary cortisol (nanomoles/day), adrenaline, noradrenaline and dopamine (nanomoles/mmole of creatine), according to age, for boys and girls. The regression equations are given for the whole sample.
Tabl. II - Coefficients de corrélation des rangs de Spearman entre dosages hormonaux et âge selon les unités choisies. * : P ≤0.05 ; ** : P ≤0.01.
Table II—Spearman’s coefficients of correlation between hormonal values and age in relation to defined units. *: P ≤0.05; **: P ≤0.01.
19L’expérience de ce travail donne quelques indications sur la façon d’adapter aux conditions de terrain la mesure biologique du stress dans le cas particulier où les observations portent sur des enfants dans leur milieu familial, dans des conditions normales d’existence et non plus seulement en contexte hospitalier. Les contraintes sont nombreuses : physiologiques pour tenir compte des variations non directement liées au stress, psychologiques pour choisir le mode d’investigation le moins invasif possible, sociologiques pour respecter les spécificités et les cultures familiales, et techniques enfin pour garantir la qualité et la précision des mesures sans avoir à manipuler de produits dangereux.
20D’un point de vue physiologique, on sait que les hormones de stress subissent des fluctuations importantes au cours de la journée, en liaison avec l’état de veille (Linder et al. 1990). Ces fluctuations rendent la mesure de l’activité surrénalienne, par une observation unique au cours du nycthémère, totalement imprécise, que cette observation porte sur un prélèvement urinaire (Schmitt et al. 1998) ou salivaire (Flinn 1999). De plus, un prélèvement unique, même s’il n’est pas invasif, peut occasionner un stress. En effet, en ne pratiquant qu’un seul prélèvement (une seule miction pour les urines), on prend le risque de mesurer le stress lié au recueil et non pas celui faisant l’objet de l’étude. Si l’on multiplie les prélèvements sur la journée ou si l’on recueille les urines des 24 h, un phénomène d’habituation se produit tandis que l’impact de l’agent stressant dû au prélèvement devient moins important.
21Pollard (1995) suggère d’effectuer plusieurs prélèvements de salive par jour (cinq prises lui semblent être un bon compromis). Cinq dosages seraient suffisants pour estimer l’allure de la courbe des variations nycthémérales du cortisol et, si la bonne marche de « l’horloge biologique » est effective, la quantité globale de cortisol sécrétée. Ces conditions de prélèvement salivaire présentent l’inconvénient d’être assez lourdes à mettre en oeuvre. En effet, elles imposent de connaître avec précision l’heure de lever des sujets le jour du recueil. Elles nécessitent la présence d’un opérateur à cinq reprises au cours de la même journée auprès de chaque sujet, ce qui est difficile à réaliser dans le cadre d’une enquête à domicile, dans un contexte de vie normale et sur de nombreux enfants. De plus, la technique de dosage du cortisol dans la salive nécessite une extraction préalable qui la rend d’autant plus coûteuse en temps et en main d’oeuvre qu’il faut pratiquer plusieurs dosages par sujet, et que ces dosages ne sont en général pas pratiqués en routine par les laboratoires hospitaliers.
22Le choix de travailler à partir de salive comme substrat se heurte à d’autres obstacles. Outre le coût élevé des analyses, la quantité de salive nécessaire au dosage (1 à 3 ml selon les auteurs) peut s’avérer difficile, voire impossible, à recueillir, surtout chez les enfants. Même chez les adultes, le recueil d’une telle quantité de salive est long et laborieux. Pour notre part, nous avons eu beaucoup de peine à obtenir ne serait-ce que 1 ml de salive chez les sujets de moins de 10 ans. Ce recueil nous a en outre confronté à d’importantes réticences liées à la représentation de cette sécrétion associée au crachat, substrat considéré comme impur. Ces réticences se sont avérées moins fortes pour l’urine, peut-être mieux acceptée grâce aux habitudes occasionnées par la pratique généralisée d’examens urinaires dans les centres médicaux.
23Toutes ces raisons nous amènent à préconiser l’abandon du recueil de salive et/ou du recueil partiel d’urine, pour s’en tenir au recueil de la totalité des mictions sur un cycle de 24 h.
24Ce choix s’impose d’autant plus qu’il permet de mieux répondre à l’objectif final qui reste la quantification d’un niveau de stress chronique et non de stress occasionnels ou ponctuels tels qu’ils peuvent se produire de façon aiguë au cours d’une journée. Dans le premier cas, le dosage du cortisol urinaire semble le plus adapté, et celui des catécholamines dans le deuxième. L’absence de corrélation entre catécholamines et cortisol urinaires (tabl. III) laisse bien supposer que ces deux types d’hormones reflètent des mécanismes différents.
Tabl. III - Coefficients de corrélation de Bravais-Pearson entre les dosages hormonaux standardisés pour l’âge et le sexe. * : P ≤0,05 ; ** : P ≤0,01.
Table III—Bravais-Pearson’s correlations between homonal values. *: P ≤0,05; **: P ≤0,01.
25Dans le cas d’étude chez les enfants, il est nécessaire de prendre en compte les variations liées à la croissance. Cela ne présente a priori pas de difficulté lorsque l’âge est connu, mais peut le devenir en l’absence de données précises sur l’âge, comme c’est parfois le cas, particulièrement dans les pays en développement en l’absence d’état civil rigoureux. Or, nous avons constaté que les catécholamines même rapportées au poids, à la taille, à l’indice de corpulence (IMC) ou à la surface corporelle (SC) ne s’expriment pas de manière indépendante de l’âge. Pour pouvoir comparer des taux de catécholamines entre enfants d’âge différent, il s’avère donc indispensable de standardiser les mesures en fonction de l’âge. En revanche, pour le cortisol, la surface corporelle (SC) mieux que l’IMC, bien que tous deux calculés à partir du poids et de la taille, permet de supprimer efficacement l’effet « âge ». Une correction du cortisol en fonction de l’âge est donc possible, même sans connaître l’âge précis des enfants. Un résultat comparable montrant que les taux de cortisol rapportés à la surface corporelle sont indépendants de l’âge et du stade de développement pubertaire a été rapporté par Linder et al. (1990) chez des enfants de 8 à 17 ans, et par Gomez et al. (1991) chez des enfants de 2 à 17 ans.
26En conclusion, nous soulignerons que les anthropobiologistes expriment plus couramment les quantités de cortisol en fonction du poids (Long et al. 1993) ou de l’IMC, alors que les pédiatres (Long et al. 1993 ; Levine et al. 1994), les expriment plutôt en fonction de la surface corporelle évaluée à partir du poids et de la taille (Gehan, George 1970). Dans les deux cas, ces deux indices tiennent compte des variations de l’âge et du format corporel dans la variation de la cortisolurie des 24 h. Ces indices donnent ainsi des estimations standardisées des niveaux de stress, et permettent par la suite d’effectuer des comparaisons de ces niveaux dans des conditions environnementales contrastées, en fonction de l’organisation de la structure familiale, de la vie scolaire ou du degré de mobilité géographique ou sociale.
27Ce travail été réalisé grâce à un contrat de recherche clinique (2000-2001), « Niveau de stress de l’enfant, migration et structure familiale », de la Faculté de Médecine de La Timone, Université d’Aix-Marseille 2. Nous tenons à remercier le docteur H. Somma, Laboratoire de Médecine Nucléaire, Hôpital de La Timone, le docteur G. Fayet, Laboratoire de Biochimie, Hôpital de La Timone et le docteur J. Bras, Laboratoire de Statistiques de la Faculté de Médecine de La Timone, Marseille, pour leur soutien tout au long de ce travail.
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