Nous remercions le Plateau Technique du MNHN, site du Musée de l’Homme (plateforme Paléogénomique et Génétique Moléculaire, Musée de l’Homme) où une partie des expériences de ce projet ont été réalisées. Nous adressons également nos remerciements à M. Daniel Dalet pour le fond de carte libre de droit (http://d‑maps.com/carte.php?num_car=2224&lang=fr) utilisé pour la figure 1, et à Mme Fanny Derym pour les photographies des grottes de Soyons (fig. 2b‑2c). La photographie de la figure 2a a été initialement publiée par Pautret‑Homerville et al. (Quaternaire, Hors‑série (4), 185‑199).

1 ‑ Introduction

1Depuis leur apparition au 19^ème siècle dans la littérature scientifique (Buckland, 1829) et romanesque (Flaubert, 1881) les coprolithes, du grec kopros (excrément) et lithos (pierre), ont attiré l’attention de différentes communautés de chercheurs. Fournissant des informations sur une espèce animale et son environnement (Reinhard & Bryant, 1992), ils sont pris en considération par des disciplines aussi diverses que la palynologie (Martin & Sharrock, 1964 ; Argant, 1990), la parasitologie (Araujo et al., 1982), l’archéozoologie (Backwell et al., 2009), la taphonomie (Pesquero et al., 2011), la génétique (Poinar et al., 1998) et la génomique (Bon et al., 2012). Leur formation et leur préservation sont liées au régime alimentaire de l’animal. Ainsi, la forte teneur en calcium et en phosphate permettant la fossilisation est obtenue en particulier chez les carnivores qui consomment les os de leurs proies (Kruuk, 1976 ; Larkin et al., 2000). Par conséquent, dans les sites européens du Pléistocène moyen et supérieur, il n’est pas surprenant que la plupart des coprolithes retrouvés soient attribués à l’hyène des cavernes, broyeur d’os familier de l’espace souterrain (Fosse, 1995 ; Sanz et al., 2016).

2Bien que son statut taxonomique puisse être discuté, l’hyène des cavernes est assimilée à l’hyène tachetée africaine actuelle Crocuta crocuta, espèce très plastique morphologiquement. L’hyène des cavernes n’en serait qu’une variante chrono‑géographique (Kurtén, 1957 ; Turner, 1984 ; Werdelin & Solounias, 1991), souvent élevée au rang de sous‑espèce (Crocuta crocuta spelaea). Crocuta crocuta est connue dans le registre fossile européen depuis le début du Pléistocène moyen, en Espagne à Atapuerca TD6 (García et Arsuaga, 2001) et en Italie à Casal Selce (Sardella & Petrucci, 2012). Différentes sous‑espèces ont été décrites au cours de cette période sur la base de critères morphologiques ou métriques. Du point de vue génétique, la notion de sous‑espèce est peu solide. L’analyse de l’ADN mitochondrial de spécimens actuels d’hyène tachetée et de fossiles d’hyène des cavernes ne permet pas de les assigner à des espèces distinctes (Westbury et al., 2020). Les données sur l’ADN nucléaire des mêmes spécimens montrent une séparation des lignées, suivie d’un échange bidirectionnel de matériel génétique (Westbury et al., 2020). Par souci de parcimonie, comme il n’y a pas en principe entre espèces distinctes de flux de matériel génétique transmis à la descendance, nous désignons ici l’hyène des cavernes sous le nom de Crocuta crocuta.

3La morphologie des coprolithes d’hyène des cavernes laisse peu de doute sur leur identification (Sanz et al., 2016). Des travaux antérieurs ont montré la bonne préservation de l’ADN dans les coprolithes d’hyène des cavernes (Bon et al., 2012). L’analyse globale par séquençage massif (Bon et al., 2012 ; Palacio et al., 2017), ainsi que l’analyse ciblée au moyen de tests de PCR spécifiques (Utge et al., 2020) ont permis de mettre en évidence dans les coprolithes l’ADN de l’hyène et des espèces qu’elle a consommées. Dans cette étude nous avons étoffé le corpus de données génétiques disponibles pour les coprolithes d’hyènes en analysant des échantillons de six sites du sud de la France (fig. 1). Les sites, où sont documentées des fréquentations humaines et animales durant le Pléistocène, sont présentés ci‑dessous, du Nord au Sud.

2 ‑ Présentation des sites

2.1 ‑ Grotte‑aux‑ours (Chateaubourg, Ardèche)

4Située dans le canyon de la Goule en rive droite du Rhône, la grotte (fig. 2a) a été découverte en 1860 lors de l’ouverture d’une carrière. C’était à l’origine une grotte constituée de hautes salles jouxtant de petites galeries qui s’inclinaient au gré des strates ; elle s’ouvrait à 150 m d’altitude. Malgré quelques fouilles en 1871 et dans les années 1930, la quasi‑totalité du remplissage karstique de la grotte a malheureusement été perdu. La découverte en 1995 d’une poche d’argile et de sable très fossilifère entraîne des fouilles de sauvetage menées en urgence. Des restes osseux de Ursus spelaeus, Crocuta spelaea, Panthera (Leo) spelaea, Panthera pardus et Canis lupus sont trouvés (Pautret‑Homerville et al., 2011). Les couches B1 et B2 sont les plus riches et contiennent des coprolithes. Les ossements de très jeunes hyènes, les os de proies rongés ou régurgités ainsi que les coprolithes retrouvés dans la grotte permettent d’affirmer que celle‑ci a servi de repaire à l’hyène des cavernes. Lors des fouilles de sauvetage, des outils en silex ont également été trouvés. Peu nombreux, ce sont des éclats Levallois et des lames en silex barrémo‑bédoulien locaux. Ils sont attribuables au Paléolithique moyen et leur faible abondance suggère des intrusions ponctuelles de Néandertal dans un repaire de carnivores. Peu après les fouilles, la grotte a été détruite par l’avancée de la carrière (Pautret‑Homerville et al., 2011).

2.2 ‑ Baume Néron et le Trou‑du‑Renard (Soyons, Ardèche)

5Situé sur la face est du massif du Guercy, le réseau complexe de grottes formant le site de Soyons a été découvert par le Vicomte Lepic et J. de Lubac en 1870. Il y a actuellement sept grottes connues : la Baume Néron, la Grotte des Enfants, l’Abri Moula, la Grotte de la Madeleine, le Trou‑du‑Renard, le Trou‑du‑Mouton et le Trou‑Roland. Les deux grottes d’où proviennent nos échantillons sont la Baume Néron et le Trou‑du‑Renard.

6La Baume Néron (fig. 2b) est constituée d’une vaste salle de trente mètres de long sur dix de large. C’est la plus grande des cavités du site archéologique de Soyons. Les fouilles menées par le Vicomte Lepic et J. de Lubac dans les années qui suivirent la découverte ont permis de mettre au jour un gisement moustérien important. Les fouilles réalisées dans les années 1950 révèlent trois phases moustériennes dont la plus ancienne est encadrée par deux « charniers » (Veyrier et al., 1951). Celui qui est sus‑jacent à la plus ancienne occupation moustérienne se serait formé lorsque les Néandertaliens ont abandonné la grotte et qu’elle a servi de refuge à des carnivores. Les deux charniers, formés de nombreux restes osseux, ne présentent pas la même composition. Le plus récent, au‑dessus du niveau moustérien, est riche en coprolithes et ossements de carnivores (loup, ours et hyène des cavernes) alors que le second, plus ancien et situé sous le plus ancien niveau moustérien, révèle de nombreux restes de grand boviné et de cheval associés à l’ours des cavernes (Veyrier et al., 1951). En 1991, lors de la vérification de l’état de conservation du gisement, de nouvelles fouilles ont été réalisées. Quatre couches (I, II, III et VII) ont alors livré du matériel moustérien. Deux dents humaines d’un enfant ont été découvertes dans la couche I (Defleur et al., 1992). Un charbon de bois de Pinus sp. issu de la couche III au milieu de la séquence a été daté de 43 000 ± 1 100 ans BP par le radiocarbone (Defleur et al., 1994). La couche VII, à sa base, est très riche. Il s’agit d’une couche de sédiments brun jaunâtre peu caillouteux. L’industrie est décrite comme un Moustérien de type Quina. La faune de cette couche VII est composée de nombreux carnivores dont le loup, l’ours et l’hyène des cavernes. Le renne est l’espèce dominante, indiquant une occupation humaine durant une période froide et sèche. Sous cette couche, à la base de la séquence, les fouilles ont mis au jour une couche avec une forte densité de restes osseux et de coprolithes sans trace de présence humaine. Cette couche peut correspondre au « charnier » le plus ancien décrit par Veyrier. La Grotte de Néron a été classée monument historique en 1965 puis aménagée et ouverte au public en 1995.

7Découverte en même temps que la Baume Néron, la grotte dite du Trou‑du‑Renard (fig. 2c) est une cavité présentant d’abondantes concrétions. Elle fait partie d’un réseau karstique qui la relie notamment à l’Abri Moula situé un peu plus en contrebas sur la colline du site de Soyons (Defleur, 1995). Des fouilles anciennes ont permis de recueillir du matériel attribué au Paléolithique moyen (Gaillard et al., 1933), mais ce n’est qu’en 1989 que les parties profondes, appelées « Réseau Ursus », sont découvertes et topographiées. Des ossements de grands carnivores (ours, lion et hyène des cavernes) ainsi que des coprolithes d’hyène ont été mis au jour dans ce secteur. Cette partie de la grotte est également riche en spéléothèmes (Gardien et al., 2009). La grotte a été aménagée et ouverte au public en 1989.

2.3 ‑ Le Figuier (Saint‑Marcel‑d’Ardèche, Ardèche)

8La Grotte du Figuier (fig. 2d) est une vaste cavité située sur la rive gauche de l’Ardèche à 85 m d’altitude (39 m au‑dessus du niveau de la rivière). Connue depuis le 19^ème siècle, elle a fait l’objet de nombreuses fouilles qui ont concerné surtout la première salle (Salle 1, la plus vaste) dès les années 1940 (Combier, 1967). La grotte a livré une longue séquence à la fois pour le Paléolithique moyen et le Paléolithique supérieur‑Mésolithique‑Néolithique, dont des restes humains et des gravures du Solutréen. Les travaux effectués en 2007 et 2008 dans les trois salles ont permis de préciser le remplissage, commun à l’ensemble du réseau, et les types d’occupation (Moncel et al., 2010, 2012). L’occupation humaine des salles profondes
(2 et 3) au Paléolithique moyen se confirme. Les Hommes ont pu accéder aux salles profondes à partir de la grande salle principale (Salle 1) ou à partir d’une autre entrée située dans la Salle 3. Le site est connu pour avoir livré dans la Salle 1 deux niveaux du Paléolithique moyen, dont l’un a été attribué au Moustérien de type Quina ; le même mode opératoire a été utilisé par les chasseurs de ces deux niveaux (Moncel, 2001). Des activités de nature différente selon les salles sont envisagées. Hommes et carnivores ont fréquenté les salles profondes dans un contexte climatique froid, probablement la dernière époque glaciaire. Une date a été obtenue sur une dent de cheval issue de la Salle 1. Elle a donné un âge de 52 ± 9 ka (MIS 3) en accord avec le contexte faunique (Richard et al., 2015). Les restes d’Ursus spelaeus sont nombreux dans les salles 2 et 3, qui ont aussi livré deux coprolithes d’hyène. Les Hommes du Paléolithique supérieur ont également fréquenté le réseau de la grotte, mais de manière différente. Le Gravettien est le seul faciès clairement identifié parmi le matériel découvert dans les sondages des salles 2 et 3.

2.4 ‑ Grotte Tournal (Bize‑Minervois, Aude)

9La grotte Tournal à Bize‑Minervois (fig. 2e) est située dans les falaises calcaires rognaciennes du Minervois. Dans la première moitié du 19^ème siècle, des outils préhistoriques sont identifiés dans un niveau fossilifère « antédiluvien » (Tournal, 1827). La grotte a livré un matériel abondant, lithique et osseux, et les fouilles minutieuses d’André Tavoso ont mis en évidence la stratigraphie complexe de ce site et des occupations humaines durant le Moustérien, l’Aurignacien et le Magdalénien (Tavoso, 1987). Des restes humains ont été découverts dans tous les ensembles. Les niveaux attribués au MIS 3 et au MIS 2 sont caractérisés par une industrie majoritairement réalisée en quartzites locaux et par une exploitation particulière des chevaux et des rennes, associés aux cerfs, grands bovinés et bouquetins (Magniez, 2009 , 2010 ; Marin et al., 2020). Les carnivores, en particulier l’hyène et le loup, sont présents dans tous les niveaux du remplissage et ont laissé de nombreux indices de consommation de carcasses. Le site permet d’observer la transition Paléolithique moyen‑Paléolithique supérieur. Son intérêt est de montrer des changements climatiques majeurs, avec une péjoration nette et une réduction de la biodiversité entre les niveaux aurignaciens E1 et E3 (Magniez, 2010 ; Magniez & Boulbes, 2014). Les coprolithes étudiés proviennent des couches F et G du niveau moustérien D1.

2.5 – La Crouzade (Gruissan, AUDE)

10La grotte de la Crouzade (fig. 2f) est creusée dans les calcaires du Crétacé inférieur du massif de la Clape appartenant à la nappe des Corbières. Fouillée au début du 20^e siècle par Théophile et Philippe Héléna, qui réalisent la première description stratigraphique du site (Héléna, 1930) et depuis 2016 par Thibaud Saos et collaborateurs (Saos et al., 2020), elle livre une industrie et une faune du Pléistocène supérieur en excellent état de conservation. La coupe stratigraphique de référence (Lumley‑Woodyear, 1971 ; Saos, 2003), située au fond du boyau principal, montre une riche succession de niveaux d’occupations du Paléolithique moyen au Paléolithique supérieur (Sacchi, 1986). Des restes humains ont été découverts dans tous les ensembles, en particulier des éléments de crâne dans le niveau aurignacien qui, avec un âge de 36 014‑34 402 ans cal. BP (2σ), comptent parmi les plus anciens vestiges d’Homme anatomiquement moderne découverts en France (Henri‑Gambier & Sacchi, 2008 ; Saos et al., 2020). Trois niveaux moustériens, C6 à C8, sont actuellement en cours de fouille (Saos et al., 2020) à 65 m des porches de la grotte. Ils sont associés, de la base au sommet, à un climat humide (C8) puis froid et sec (C7), surmontés par une couche très riche en ossements d’ursidés (C6). Les carnivores, et en particulier les hyènes, sont présents dans tous les niveaux. Les coprolithes 71372‑C7 et 71377‑C7 étudiés ici proviennent de la couche 7, datée de 41 000 ± 2 000 ans BP par les séries de l’Uranium sur dent de cheval combinées à l’ESR. Les trois couches (C6‑C8) ont livré une industrie caractéristique du Paléolithique moyen de la fin du MIS 3, et un assemblage faunique riche en ossements de renne (Rangifer tarandus) et de cheval (Equus ferus germanicus), associés à l’hydrontin (Equus hydruntinus davidi), au bouquetin (Capra praepyrenaica) et aux grands bovinés (Saos et al., 2020). Des os de petits animaux consommés par l’Homme, restes aviaires et surtout de léporidés, sont également présents (Morin et al., 2019).

3 ‑ Matériel et méthodes

3.1 ‑ Échantillons

11Les échantillons de cette étude sont issus de fouilles programmées ou de fouilles préventives réalisées plusieurs années à plusieurs décennies avant la réalisation des analyses génétiques.

12Les autorisations d’analyse ont été obtenues de la part des autorités compétentes en agrément avec la législation en cours. Pour les échantillons de la Grotte‑aux‑Ours de Châteaubourg, de la Baume Néron et du Trou‑du‑Renard, l’autorisation (convention 2013.01) a été accordée par le Musée de Soyons ; pour les échantillons de la grotte du Figuier, l’autorisation (convention 2007) est celle accordée pour les fouilles programmées sur ce site ; pour les échantillons des grottes de La Crouzade et de Tournal, l’autorisation (convention MT18002) a été accordée par le Centre Européen de Recherches Préhistoriques de Tautavel.

3.2 ‑ Extraction de l’ADN

13Les extractions d’ADN ont été réalisées dans des laboratoires où aucun ADN amplifié n’a jamais été manipulé : laboratoire du CEA Saclay dédié à cette activité (Bon et al., 2012 ; Palacio et al., 2017), ou salle blanche du Musée de l’Homme à Paris (Utge et al., 2020). Les précautions utilisées contre les contaminations incluent le port d’une combinaison intégrale, d’un masque et de gants (changés fréquemment) par les expérimentateurs, l’utilisation de matériel stérile à usage unique ou d’outils soigneusement lavés et stérilisés après chaque manipulation.

14Les coprolithes analysés dans cette étude étaient dans leur état d’origine (figs. 3a ‑ 3g), à l’exception d’un des coprolithes de La Crouzade qui était verni (fig. 3h). Pour l’extraction d’ADN, les coprolithes ont été coupés en deux afin d’en rendre l’intérieur accessible au prélèvement. Cette approche évite de récupérer un excès de contaminants présents à la surface du coprolithe, qu’ils proviennent de l’environnement, de la manipulation du coprolithe pendant et après la fouille, ou de son traitement au moyen d’un vernis. L’intérieur du coprolithe a été gratté au moyen d’un scalpel à usage unique et environ 0,5 g de matériel récupéré. Aucune inclusion osseuse n’a été repérée lors des prélèvements. L’échantillon a ensuite été broyé finement pendant 30 secondes au moyen d’un Mikro‑dismembrator S (Sartorius ; Göttingen, Allemagne) réglé à fréquence de 2 000 oscillations par minute. L’extraction de l’ADN a été réalisée selon le protocole précédemment décrit (Utge et al., 2020) en l’adaptant à des échantillons de 0,5 g. Brièvement, la poudre de coprolithe est transférée dans un tube Falcon de 15 ml contenant 5 ml de tampon d’incubation (EDTA 0,25M, Tris‑HCl 10mM (pH 8), N‑lauryl‑sarcosyl 0,2 %, protéinase K 200 µg/ml). Après 16h d’incubation à 42°C sous agitation rotative, l’échantillon est centrifugé 5 minutes à 5 000 g. Le surnageant est récupéré, déposé par fractions de 1‑2 ml sur une colonne de dialyse Amicon de 2 ml (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) d’une porosité de 30 kDa, en réalisant une centrifugation de 20 minutes à 3 000 g après chaque ajout de surnageant. La colonne est ensuite rincée quatre fois avec 2 ml d’eau distillée. L’extrait d’ADN est récupéré en centrifugeant la colonne en position inverse 1 minute à 1 000 g, puis soumis à une purification supplémentaire sur une colonne de silice (MinElute PCR purification kit ; Qiagen ; Venlo, Pays‑Bas) en suivant les recommandations du fournisseur. Enfin, l’ADN est élué de la colonne avec du tampon Tris‑HCl 10 mM (pH 8.0) et récupéré dans un volume final de 100 µl.

3.3 ‑ Analyse de l’ADN par PCR en temps réel

15la PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour vérifier la présence d’adn d’hyène des cavernes dans les coprolithes préalablement au séquençage massif. elle a été réalisée en utilisant les amorces et la sonde taqman préalablement décrites (utge et al., 2020). les amplifications ont été effectuées dans un volume final de 20 µl contenant 10 µl de 2x taqman fast advanced master mix (thermo fisher scientific), les amorces sens et anti‑sens (900 nm), la sonde taqman (250 nm), et de l’eau (blanc de PCR), un blanc d’extraction ou une aliquote de l’extrait d’adn. l’amplification a été effectuée dans l’appareil de PCR en temps réel cfx96 touch (biorad, hercules, californie, usa). elle comportait les étapes suivantes : 50°c, 2 minutes ; 95°c, 20 secondes ; suivies de 40 cycles de PCR (95°c, 3 secondes ; 60°c, 30 secondes). les données ont été analysées au moyen du logiciel cfx maestro de la société biorad pour calculer le cycle seuil (cycle threshold, ou c_t), qui correspond au nombre de cycles de PCR à partir duquel le signal fluorescent devient significativement différent de la ligne de base.

16la vérification de la présence d’adn d’hyène des cavernes dans les coprolithes a été effectuée en analysant trois quantités de chaque extrait (0,1 ; 0,3 et 0,9 µl). comme l’objectif était de sélectionner des coprolithes susceptibles de fournir des banques complexes, c’est‑à‑dire des banques contenant une grande quantité de fragments d’adn, seuls les coprolithes présentant un c_t ≤ 35 pour l’amplification de l’adn d’hyène à partir de 0,3 µl d’extrait ont été retenus. ont ainsi été exclus des analyses ultérieures un coprolithe de la grotte du figuier et un coprolithe de la grotte tournal. à partir des données de PCR en temps réel nous avons choisi, pour la construction des banques, d’utiliser des quantités d’extrait comprises entre 1 µl et 10 µl selon les échantillons.

3.4 ‑ Construction de banques de fragments d’ADN

17Des banques de fragments d’ADN compatibles avec le séquençage massif au moyen de la méthode Illumina (Bentley et al., 2008) ont été construites en utilisant les réactifs Illumina (TruSeq Nano DNA LT sample kit FC‑121‑4001 ; San Diego, Californie, USA). Les banques ont été obtenues en suivant les recommandations du fournisseur, à l’exception de modifications introduites en raison des particularités de l’ADN ancien, qui se présente sous la forme de courts fragments. Ainsi, l’étape initiale de préparation de la banque (fragmentation de l’ADN) n’a pas été effectuée. Le protocole de construction des banques, avec 12 cycles de PCR pour l’amplification des banques, était identique à celui décrit par Palacio et al. (2017).

3.5 ‑ Séquençage de l’ADN

18Le séquençage des banques a été réalisé au Génoscope (CEA Evry, France) sur la plateforme Illumina HiSeq 2500. Une aliquote de chaque banque a été déposée sur une ligne d’une lame à huit lignes, sauf pour l’échantillon de Néron, qui a été déposé sur 3 lignes. La longueur de lecture sélectionnée était de 101 nucléotides, et le séquençage réalisé à partir d’une seule extrémité de chaque fragment.

3.6 ‑ Traitement des données de séquence d’ADN et alignement des lectures

19Les données de séquence, ou lectures, ont été traitées de façon à éliminer les séquences des adaptateurs, les bases indéterminées et les séries de bases de faible qualité. Ceci a été réalisé à l’aide d’un logiciel, conçu par le Génoscope, dérivé du programme FASTX‑Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/​fastx_toolkit). Les lectures de longueur inférieure à 30 nucléotides ont ensuite été exclues. Le tableau 1 donne pour chaque échantillon le nombre total de lectures disponible après traitement des données de séquence.

20Pour l’analyse des séquences mitochondriales, les lectures de toutes les banques ont d’abord été alignées simultanément sur un ensemble de 35 génomes mitochondriaux incluant le génome de référence de Crocuta crocuta (GenBank NC_020670.1) (Bon et al., 2012) et les génomes mitochondriaux de plusieurs animaux potentiellement sources de nourriture pour l’hyène. Les alignements ont été réalisés en utilisant le logiciel BWA v0.7.12 (Li & Durbin, 2009) et les fichiers ont été analysés avec le logiciel SAMtools v1.3.1 (Li et al., 2009). Seules ont été prises en compte les lectures uniques s’alignant parfaitement sur les génomes mitochondriaux cibles, sans mésappariement, insertion ou délétion, et avec une qualité d’alignement (mapping quality) supérieure à 25. Ce premier alignement avait pour objectif de vérifier l’identité de l’espèce à l’origine du coprolithe, et de fournir des informations sur son bol alimentaire.

21Pour l’analyse des séquences nucléaires, les lectures des banques correspondant aux coprolithes Châteaubourg 1, Néron 2, Trou‑du‑Renard 1, Tournal 143 et Crouzade 71372 (qui présentaient le plus de lectures correspondant à l’ADN mitochondrial de Crocuta) ont été alignées sur l’assemblage du génome nucléaire PEQU00000000 de l’hyène rayée (Hyaena hyaena) (Westbury et al., 2018) en utilisant l’algorithme aln (‑n 0.01, ‑l 999) du logiciel BWA v0.7.12 et les fichiers analysés avec le logiciel SAMtools v1.3.1. Les lectures alignées présentes en doublon ont été éliminées en utilisant SAMtools. La couverture moyenne du génome nucléaire ainsi obtenue est indiquée dans le tableau 2.

22Nos données pour les génomes nucléaires d’hyène ont été comparées à celles de Westbury et al. (2020). Nous avons analysé tous les spécimens anciens eurasiatiques (Ccsp014, Ccsp015, Ccsp026, Ccsp040, Ccsp041, Ccsp042 et Ccsp043) de cette étude, ainsi que quatre spécimens actuels d’Afrique : Ghana, Zambia2518, Tanzania5695 et Kenya793. Nous avons procédé pour ces alignements comme spécifié précédemment (Westbury et al., 2020). Le traitement appliqué aux lectures issues des spécimens anciens et actuels est présenté ci‑dessous.

23Les lectures des banques des spécimens anciens ont été traitées pour éliminer les séquences des adaptateurs Illumina et les lectures trop courtes ont été supprimées (en utilisant les longueurs minimales indiquées par Westbury et al., (2020) pour chaque banque) à l’aide du logiciel Cutadapt v1.8.1 (Martin, 2011). Les lectures ainsi traitées ont été alignées sur l’assemblage du génome de l’hyène rayée en utilisant l’algorithme aln (‑n 0.01, ‑l 999) du logiciel BWA v0.7.12 (Li & Durbin, 2009) et les fichiers analysés avec le logiciel SAMtools v1.3.1 (Li et al., 2009). Les lectures alignées présentes en doublon ont été éliminées en utilisant SAMtools.

24Les lectures des banques des spécimens actuels ont été traitées pour éliminer les séquences des adaptateurs, et les lectures de longueur inférieure à 30 nucléotides ont été supprimées à l’aide du logiciel Cutadapt v1.8.1. Les lectures chevauchantes ont ensuite été fusionnées en utilisant le logiciel FLASH v1.2.1 (Magoč & Salzberg, 2011). Les lectures ainsi traitées ont été alignées sur l’assemblage du génome de l’hyène rayée en utilisant l’algorithme mem du logiciel BWA v0.7.12 et les fichiers analysés avec le logiciel SAMtools v1.3.1. Les lectures alignées présentes en doublon ont été éliminées en utilisant SAMtools.

3.7 ‑ Reconstruction des génomes mitochondriaux

25La reconstruction du génome mitochondrial d’hyène de tous les spécimens à l’origine des coprolithes, à l’exception de celui de la Baume Néron, a été effectuée de la façon suivante : les lectures ont été alignées uniquement sur le génome de référence de Crocuta crocuta en utilisant le logiciel BWA v0.7.12 et ses paramètres par défaut, c’est‑à‑dire en permettant une seule insertion ou délétion par lecture et une fraction d’alignements manquants de 0,04, ce qui adapte le nombre de mésappariements tolérés à la longueur de la lecture. Les lectures alignées ont ensuite été analysées par le logiciel SAMtools pour ne conserver que les lectures présentant une qualité d’alignement supérieure à 25. Les lectures sélectionnées ont été traitées par le logiciel mapDamage2.0 (Jónsson et al., 2013) qui a permis de vérifier que toutes les banques montraient l’endommagement attendu pour l’ADN ancien amplifié avec l’ADN polymérase Phusion (Jónsson et al., 2013 ; Marsolier‑Kergoat et al., 2015 ; Palacio et al., 2017). Les transitions C vers T aux extrémités 5’ ne sont pas présentes car l’enzyme Phusion interrompt la polymérisation au niveau des cytosines désaminées. En revanche, aux extrémités 3’ préalablement réparées par copie du brin complémentaire avec la polymérase Klenow, d’abondantes transitions G vers A sont détectées. Ceci est illustré sur la figure 4 pour la banque obtenue à partir du coprolithe Néron 2. Le score des bases situées aux extrémités a été réévalué au moyen de mapDamage2.0 afin que les bases avec une forte probabilité d’endommagement ne soient pas prises en compte dans la reconstruction du génome. Les lectures alignées présentes en doublon ont ensuite été éliminées en utilisant SAMtools, et une première séquence a été reconstruite en prenant comme base consensus pour chaque position du génome la base la plus fréquemment observée dans les lectures alignées, avec un minimum de deux lectures concordantes. Cette première séquence reconstruite a ensuite servi de matrice pour réaligner toutes les lectures, permettant à de nouvelles lectures de s’aligner sur ce génome plus proche de celui correspondant aux fragments d’ADN de la banque. Ce cycle d’alignement/correction des bases aux extrémités avec élimination des séquences dupliquées et reconstruction d’une séquence consensus a été itéré jusqu’à ce que le génome mitochondrial reconstruit ne varie plus d’un cycle à l’autre (entre 3 et 5 itérations selon les banques).

26L’analyse préliminaire de la banque du coprolithe de la Baume Néron a montré qu’elle contenait un grand nombre de lectures s’alignant sur un génome mitochondrial de cheval (Equus caballus, référence de GenBank NC_001640). Pour éviter que le génome mitochondrial reconstruit pour l’hyène ne soit altéré par des lectures correspondant au génome mitochondrial d’un équidé qui pourraient s’aligner de façon illégitime sur le génome d’hyène, nous avons procédé comme décrit précédemment mais en alignant les lectures simultanément sur un génome d’hyène et un génome de cheval (les deux génomes utilisés pour le premier cycle d’alignement sont les mêmes que ceux précédemment employés : NC_020670.1 et NC_001640). Des consensus pour les deux génomes mitochondriaux, celui de l’hyène et celui de l’équidé, ont ainsi été construits à chaque itération, jusqu’à ce que l’ensemble n’évolue plus d’une itération à l’autre.

3.8 ‑ Analyses phylogénétiques des génomes mitochondriaux

27Les analyses phylogénétiques ont été réalisées en utilisant le logiciel MEGA X (Kumar et al., 2018). Les séquences consensus de Crocuta crocuta que nous avons reconstruites ont été alignées avec le génome mitochondrial de référence de l’hyène rayée (Hyaena hyaena, GenBank NC_020669.1) (Bon et al., 2012), le génome de Crocuta crocuta utilisé initialement pour l’alignement des lectures, le génome d’un spécimen moderne de Crocuta crocuta (Kira, GenBank JF894377) (Bon et al., 2012) et 20 génomes mitochondriaux de Crocuta crocuta tant anciens que modernes précédemment publiés (Palacio et al., 2017 ; Westbury et al., 2020). Nous avons construit un arbre phylogénétique à partir de cet alignement en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance et le modèle général réversible (General Time Reversible model) (Nei & Kumar, 2000). Les positions dont la base a été déterminée dans moins de 95 % des séquences ont été éliminées ; au total 15 064 positions ont été prises en compte. Les arbres initiaux pour la recherche heuristique ont été obtenus en appliquant les algorithmes Neighbor‑Joining et BioNJ à une matrice de distances évaluée avec une approche de maximum de vraisemblance composée (Maximum Composite Likelihood), et en sélectionnant ensuite la topologie avec la plus forte valeur de vraisemblance. Une distribution Gamma avec 5 catégories a été utilisée pour modéliser les différences des taux d’évolution à différentes positions de la séquence nucléotidique.

3.9 ‑ Analyses en composantes principales des génomes nucléaires

28Les analyses en composantes principales (ACP) ont été réalisées comme décrit par Westbury et al. (2020) en utilisant un échantillonnage des bases au moyen du logiciel ANGSD v0.913 (Korneliussen et al., 2014) de façon à éviter les biais que pourraient induire les différences de couverture entre les génomes. Les filtres suivants ont été appliqués : n’ont été considérées que les lectures avec une qualité d’alignement supérieure à 25, qui s’alignaient à un seul endroit du génome (‑uniqueOnly 1) ; les lectures considérées comme « mauvaises » (bad) par ANGSD ont été éliminées (‑remove_bads 1) ; seules les bases de qualité supérieure à 25 (‑minQ 25) ont été prises en compte ; enfin, seules les transversions et seuls les sites qui étaient couverts chez au moins 7 échantillons avec la fréquence de l’allèle minoritaire supérieure à 0,1 ont été considérés.

3.10 ‑  Analyses phylogénétiques des génomes nucléaires

29Ces analyses ont été menées selon les procédures décrites ailleurs (Westbury et al., 2020). En particulier, les sites des séquences alignées sur l’assemblage de l’hyène rayée ont été sélectionnés en appliquant les mêmes filtres, puis pseudohaploïdisés en utilisant la fonction d’échantillonnage aléatoire du logiciel ANGSD v0.913 (Korneliussen et al., 2014). Les 333 contigs de l’assemblage dont la longueur était supérieure à 2 millions de paires de bases (Mpb) ont été découpés en segments de 2 Mpb non chevauchants, d’où 467 segments. Les bases des sites ont été binarisées et un arbre phylogénétique a été construit pour chaque segment au moyen de la méthode du maximum de vraisemblance en utilisant le logiciel RAxML v8.2.10 (Stamatakis, 2014) avec le modèle de substitution BINGAMMA et en spécifiant l’hyène rayée comme groupe externe. Finalement les 467 arbres partiels ont été combinés en un seul arbre consensus en utilisant le logiciel PHYLIP v3.6 (J. Felsenstein, PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6 (2005) ; http://evolution.genetics.washington.edu/​phylip/​).

3.11 ‑ Datations radiocarbone

30Les datations ont été réalisées sur la matrice des coprolithes, au sein de laquelle aucun résidu osseux n’était visible. La préparation des échantillons consistait en un traitement par l’acide (HCl 0,5M) à température ambiante, suivi d’une lyophilisation, d’une combustion pour la production de CO₂, et d’une conversion du CO₂ en graphite. Les datations ¹⁴C ont été réalisées au moyen de la méthode de spectrométrie de masse par accélérateur (AMS) à l’Université de Californie à Irvine (UCIAMS). L’âge calibré de chaque échantillon avant le présent (cal. BP) a été calculé en utilisant le logiciel OxCal 4.4 (Ramsey, 2009) et la courbe de calibration IntCal20 (Reimer et al., 2020).

4 ‑ Résultats et discussion

4.1 ‑ Caractérisation génétique de l’espèce à l’origine des coprolithes et analyse de son alimentation

31Nous avons analysé par séquençage massif le contenu en ADN de huit coprolithes provenant de 6 sites : un échantillon de la Grotte‑aux‑Ours de Châteaubourg, un échantillon des grottes de Néron et du Trou‑du‑Renard du site de Soyons, un échantillon de la grotte du Figuier, deux échantillons de la grotte Tournal et deux échantillons de la grotte de la Crouzade.

32Les lectures de fragments d’ADN correspondant à chaque échantillon ont d’abord été alignées sur un ensemble de 35 génomes mitochondriaux, incluant un génome de Crocuta crocuta et les génomes de plusieurs proies potentielles de l’hyène. Les lectures ont été alignées simultanément sur les 35 génomes et seules celles qui s’alignaient parfaitement, sans insertion, délétion ou mésappariement sur un seul des 35 génomes ont été retenues. Cette approche présente l’avantage d’éliminer les séquences qui se retrouvent dans plusieurs génomes, et qui sont donc peu spécifiques, mais limite le nombre de génomes qui peuvent être introduits dans l’analyse. En effet, si plusieurs génomes d’espèces génétiquement proches sont criblés simultanément, de nombreuses lectures s’aligneront sur plusieurs de ces génomes et seront éliminées par notre crible : l’ADN de ces espèces sera, à tort, jugé absent (faux négatif). Pour cette raison, la liste des 35 génomes ne comprend qu’une seule espèce pour chaque genre. Un résultat positif peut ensuite être approfondi en faisant une nouvelle série d’alignements sur un nombre plus limité de génomes génétiquement proches pour déterminer plus précisément l’espèce dont l’ADN est présent dans le coprolithe (voir ci‑dessous).

33Le tableau 3 présente les résultats obtenus en alignant les lectures de chaque banque sur les 35 génomes. Comme attendu d’après la morphologie des coprolithes, le génome sur lequel s’alignent le plus grand nombre de lectures est pour chaque échantillon celui de Crocuta crocuta, ce qui confirme qu’il s’agit bien dans tous les cas de coprolithes d’hyène.

34En ce qui concerne les autres génomes, l’abondance des lectures alignées suggère dans certains cas que les espèces correspondantes ont pu faire partie du bol alimentaire. En complément du nombre de lectures alignées, nous avons utilisé un deuxième critère pour caractériser les lectures mitochondriales attribuées à une espèce donnée, à savoir la répartition de ces lectures le long du génome. Nous avons considéré tous les génomes mitochondriaux sur lesquels s’alignent au moins 30 lectures pour au moins un des coprolithes étudiés (ce seuil de 30 a été choisi de façon arbitraire, de façon à pouvoir évaluer qualitativement la répartition des lectures alignées sur les génomes). Sept génomes mitochondriaux sont dans ce cas : celui du bison des steppes (Bison priscus), de l’aurochs (Bos primigenius), du rhinocéros laineux (Coelodonta antiquitatis), du cheval (Equus caballus), du renne (Rangifer tarandus), du saïga (Saiga tatarica) et de l’ours des cavernes (Ursus spelaeus). La figure 5 montre le nombre de lectures commençant à chaque position des sept génomes mitochondriaux pour les six coprolithes dont les données, pour au moins un de ces génomes, correspondent à au moins 30 lectures alignées.

35Si un coprolithe contient de l’ADN mitochondrial d’une espèce donnée, on s’attend à ce que les fragments de cet ADN s’alignent sur des séquences réparties de façon relativement uniforme le long du génome. Le cas est particulièrement clair pour les lectures du coprolithe Néron 2 s’alignant sur un génome mitochondrial de cheval (Equus caballus) : on observe en effet un grand nombre de lectures (2 165) qui se répartissent régulièrement le long du génome (fig. 5). Cette observation nous a d’ailleurs incités à aligner les lectures de cette banque simultanément sur des génomes mitochondriaux de cheval et d’hyène afin de reconstruire le génome mitochondrial de l’hyène sans que la séquence consensus ne soit affectée par les lectures correspondant au génome d’un équidé (voir Matériel et Méthodes). Le génome mitochondrial de l’équidé a également été reconstruit avec une valeur médiane de 8 pour la couverture (nombre de lectures incluant une position donnée du génome). La comparaison de cette séquence consensus avec une base de données de séquences d’ADN (sur le site blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, test effectué le 29 juillet 2020) démontre sans ambiguïté qu’il s’agit du génome mitochondrial d’un spécimen de cheval puisque les cent séquences les plus proches, avec des pourcentages d’identité supérieurs à 98,5 %, correspondent toutes à des génomes mitochondriaux d’Equus caballus. L’identité avec le génome mitochondrial d’autres équidés est moindre (Equus hydruntinus, 93,2 % ; Equus asinus, 92,0 %). En l’absence d’information sur le génome mitochondrial des chevaux présents à la fin du Pléistocène dans le sud de la France (Equus caballus germanicus, gallicus et arcelini) (Brugal et al., 2020) il n’est pas possible d’identifier formellement l’espèce de cheval dont l’ADN est présent dans le coprolithe de la Baume Néron.

36Outre les lectures alignées sur le génome mitochondrial de cheval, on observe aussi que 65 et 53 lectures du coprolithe Néron 2 s’alignent respectivement avec une répartition régulière sur les génomes mitochondriaux de bison des steppes et d’aurochs (fig. 5). Cette observation nous a paru surprenante car on s’attend, en ce qui concerne ces proies de grande taille, à ce que le bol alimentaire de l’hyène comprenne le plus souvent une espèce, parfois deux, mais rarement trois. Étant donné la forte ressemblance des séquences des génomes mitochondriaux de bison des steppes et d’aurochs, il semblait possible que l’animal consommé appartienne en fait à une autre espèce de boviné, dont certaines parties de l’ADN mitochondrial sont suffisamment semblables à des séquences mitochondriales du bison des steppes ou de l’aurochs pour s’y aligner. Deux autres lignées de grand boviné sont présentes en Europe à la fin du Pléistocène : le bison d’Europe (Bison bonasus) et une lignée de bison baptisée X (Soubrier et al., 2016) ou Bb1 (Massilani et al., 2016) mais qui pourrait correspondre au bison des forêts (Bison schoetensacki) (Palacio et al., 2017). C’est sous ce nom que la désignons ici. Nous avons réaligné la banque du coprolithe Néron 2 simultanément sur les génomes mitochondriaux du bison des steppes, de l’aurochs et du bison des forêts. Nous avons alors obtenu 17 lectures pour le bison des steppes, 19 lectures pour l’aurochs et 495 lectures pour le bison des forêts. L’expérience complémentaire consistant à réaligner la banque du coprolithe Néron 2 simultanément sur les génomes mitochondriaux du bison des steppes, de l’aurochs et du bison d’Europe a donné 37 lectures pour le bison des steppes, 32 lectures pour l’aurochs et 233 lectures pour le bison d’Europe. Le nombre deux fois plus élevé de lectures pour le bison des forêts que pour le bison d’Europe, et la vérification de la répartition homogène de ces lectures le long de l’ADN mitochondrial du bison des forêts (fig. 6) suggèrent fortement que les lectures s’alignant sur les différents génomes de bovinés (bison des steppes, aurochs, bison des forêts et bison d’Europe) correspondent en fait à des fragments d’ADN de bison des forêts et donc que le coprolithe de Néron 2 contient à la fois de l’ADN de cheval et de l’ADN de bison des forêts.

37Une répartition régulière des lectures alignées s’observe aussi sur le génome mitochondrial d’ours des cavernes pour le coprolithe Trou‑du‑Renard 1, sur le génome mitochondrial de rhinocéros laineux pour le coprolithe Le Figuier 1, et sur le génome mitochondrial de renne pour le coprolithe Tournal 143 (fig. 5). Dans ces trois cas, le nombre de lectures alignées, dont l’abondance est spécifique d’un coprolithe particulier (les autres coprolithes servant de témoins négatifs d’une certaine façon) et la distribution de ces lectures sur les génomes suggèrent fortement qu’un spécimen de l’espèce correspondante a fait partie du bol alimentaire. L’alignement simultané des lectures obtenues pour le coprolithe du Trou‑du‑Renard sur les génomes mitochondriaux de deux ursinés confirme que c’est vraisemblablement l’ours des cavernes (250 lectures) plutôt que l’ours brun (46 lectures) qui faisait partie du bol alimentaire de l’hyène.

38Le génome mitochondrial de saïga illustre une situation différente de celles décrites jusqu’à présent. On peut d’abord remarquer que trois coprolithes fournissent plus de 30 lectures s’alignant sur ce génome (tab. 3). Par ailleurs, ces lectures apparaissent toujours concentrées en quelques endroits de la séquence, dont un se retrouve dans tous les cas présentant plus de 30 lectures alignées (fig. 5). Cette configuration serait très peu probable si de l’ADN de saïga se trouvait dans ces coprolithes. Nous n’avons donc pas d’argument fort en faveur de la présence d’ADN de saïga dans les coprolithes étudiés.

39L’étude des ossements accumulés dans les repaires d’hyène des cavernes montre que cette espèce consommait une diversité de grands mamifères (Diedrich & Zak, 2006 ; Fourvel et al., 2014). Nos analyses génétiques valident cette notion et révèlent en particulier quatre bols alimentaires différents (Néron 2: cheval et bison des forêts ; Trou‑du‑Renard 1: ours des cavernes ; Le Figuier 1: rhinocéros laineux ; Tournal 143 : renne) pour les quatre coprolithes qui livrent une information sur le régime alimentaire de l’hyène. Dans trois cas (Néron, Trou‑du‑Renard, Tournal), les animaux consommés par l’hyène font partie du paléoenvironnement déduit de l’analyse des sites, bien que pour Néron les équidés et les grands bovinés se situent dans un charnier différent de celui où se trouvent les coprolithes. La présence d’ADN de rhinocéros laineux dans le coprolithe de la grotte du Figuier ouvre de nouvelles perspectives pour l’analyse du paléoenvironnement du site puisqu’aucun reste de rhinocéros n’a jusqu’à présent été découvert dans la grotte. La possibilité d’une sélection d’espèces différentes par les humains et les hyènes, de même que la fréquentation du site par les humains et les hyènes à des époques différentes, font partie des notions qu’il conviendra d’approfondir à l’occasion d’autres études.

40Les résultats de cette étude et ceux de travaux antérieurs (Bon et al., 2012 ; Palacio et al., 2017 ; Utge et al., 2020) portent à 9 le nombre de coprolithes d’hyène pour lesquels des analyses génétiques ont livré une information sur le régime alimentaire de l’hyène. Jusqu’à présent, seule la consommation de grands mamifères a été mise en évidence, et le nombre d’espèces détectées (6 pour 9 coprolithes) souligne la diversité du régime alimentaire de l’hyène. Les 6 espèces dont l’ADN a été trouvé dans les coprolithes d’hyène sont le bison des forêts, le cerf élaphe, le cheval, l’ours des cavernes, le renne et le rhinocéros laineux. L’ADN de cerf élaphe a été trouvé dans deux coprolithes d’un même site (Bon et al., 2012). La seule récurrence frappante à ce stade est celle du bison des forêts, dont l’ADN a été détecté dans quatre coprolithes de trois sites différents (Palacio et al., 2017 ; Utge et al., 2020 ; et la présente étude). À titre d’hypothèse, nous proposons que cette association pourrait aider à définir le biotope de l’hyène des cavernes.

41Parmi les huit coprolithes de la présente étude, quatre seulement livrent une information sur les animaux consommés par l’hyène des cavernes. Les résultats négatifs pour les autres coprolithes peuvent être expliqués par différentes raisons. Premièrement, les 35 genres recherchés (tab. 3) représentent un nombre important d’espèces mais ne prétendent être une liste exhaustive ni définitive pour explorer la diversité de l’alimentation de l’hyène. Comme les séquences d’ADN de cette étude ont été déposées dans la base de données EBI, l’analyse pourra être poursuivie sur d’autres génomes mitochondriaux et les génomes nucléaires de nombreuses espèces. La seconde raison qui pourrait expliquer la difficulté à identifier le contenu du bol alimentaire est le cannibalisme, comportement connu chez l’hyène tachetée actuelle (Frank, 1994) et l’hyène des cavernes (Diedrich & Zak, 2006 ; Diedrich 2011). Lorsque c’est le cas, on ne peut s’attendre à retrouver un ADN autre que celui de l’hyène dans les coprolithes. Troisièmement,
il convient de mentionner que les différents tissus animaux contiennent des quantités inégales d’ADN. Celui‑ci est en effet beaucoup plus abondant dans les tissus mous, en particulier le foie, que dans l’os compact, où la quantité par gramme de tissu frais est 100 à
1 000 fois plus faible (Hochmeister et al., 1991 ; Hofstetter et al., 1997). Ainsi, un coprolithe correspondant à un bol alimentaire pauvre en tissus mous contiendra peu d’ADN de l’animal consommé.

4.2 ‑ Reconstruction et analyse phylogénétique des génomes mitochondriaux d’hyène

42Nous avons ensuite reconstruit le génome mitochondrial d’hyène présent dans les huit coprolithes étudiés. Le tableau 1 montre que la valeur médiane de la couverture des génomes reconstitués varie entre 3 et 65. Les génomes mitochondriaux reconstitués à partir de tous les coprolithes étudiés (mis à part celui du Figuier 1, dont la couverture était faible) ont été comparés à d’autres génomes de Crocuta crocuta précédemment obtenus à partir de spécimens eurasiatiques du Pléistocène supérieur et de spécimens modernes d’origine sub‑saharienne, présents dans différents pays d’Afrique ou des zoos (Bon et al., 2012 ; Palacio et al., 2017 ; Westbury et al., 2020). L’arbre phylogénétique obtenu par la méthode du maximum de vraisemblance (fig. 7) montre que les génomes se répartissent dans les quatre haplogroupes identifiés lors d’études antérieures (Rohland et al., 2005 ; Westbury et al., 2020).

43Les génomes de la présente étude se trouvent dans deux de ces haplogroupes seulement. Les génomes des coprolithes Châteaubourg 1, Trou‑du‑Renard 1, Crouzade 71372, Crouzade 71377, Tournal 143 et Tournal 106 forment un clade de séquences très proches au sein de l’haplogroupe A, tandis que le génome du coprolithe Néron 2 fait partie de l’haplogroupe B. Comme observé précédemment (Westbury et al., 2020), l’haplogroupe A présente la particularité de rassembler des génomes d’hyènes européennes du Pléistocène supérieur et d’hyènes sub‑sahariennes modernes. Cependant, alors que les génomes analysés par Westbury et collaborateurs se répartissaient à l’intérieur de l’haplogroupe A en deux clades réciproquement monophylétiques, l’un formé de séquences anciennes d’origine européenne et l’autre de séquences modernes d’origine africaine, cette partition disparaît avec l’addition des génomes que nous avons reconstruits. En effet, le clade formé par les séquences Châteaubourg 1, Trou‑du‑Renard 1, Crouzade 71372, Crouzade 71377, Tournal 106 et Tournal 143 est plus proche phylogénétiquement de spécimens actuels d’hyène de Somalie ou du Ghana que du clade comportant les génomes anciens de France, d’Allemagne et d’Ukraine. Des flux génétiques entre les lignages des hyènes anciennes européennes et des hyènes africaines ont été mis en évidence par Westbury et al. (2020) qui suggèrent, pour expliquer le regroupement de génomes mitochondriaux d’origines européenne et africaine au sein de l’haplogroupe A, un ou plusieurs événements d’introgression dont le sens n’est pas déterminé, soit des hyènes européennes vers les hyènes africaines, soit l’inverse.

44Les mêmes auteurs ont noté la répartition dans deux haplogroupes mitochondriaux (A et B) de spécimens anciens géographiquement proches, retrouvés sur le territoire actuel de l’Allemagne. Nous avons observé le même phénomène à une échelle encore plus restreinte puisque les coprolithes du Trou‑du‑Renard et de la Baume Néron, pour lesquels les génomes d’hyène appartiennent respectivement aux haplogroupes A et B, ont été collectés tous les deux sur le site de Soyons. Ne disposant pas de datation directe pour leur échantillon de l’haplogroupe A (Ccsp040), Westbury et al. (2020) ne pouvaient écarter l’hypothèse que les différents spécimens d’Allemagne vivaient à des périodes différentes, entre lesquelles s’était produit un remplacement d’haplogroupe. La datation radiocarbone du coprolithe du Trou‑du‑Renard donne un âge de 25 800‑25 290 cal. BP (tab. 4). Cette date, gravettienne, est postérieure à celle (31 000 cal. BP) proposée pour la disparition de l’hyène des cavernes en Europe (Stuart et Lister, 2014) qui ne tient pas compte toutefois de toute une série de données. En effet l’hyène des cavernes, tout en se raréfiant, persiste bien au‑delà, au moins jusqu’au Gravettien (Boulestin et al., 2006 ; Discamps, 2011), voire plus tardivement encore. Elle est par exemple signalée à 22 120‑21 820 cal. BP en Allemagne (Westbury et al., 2020) et dans les niveaux de l’ensemble magdalénien de la grotte Tournal (Magniez, 2010). L’âge obtenu pour le coprolithe de Néron est de 30 890‑30 180 cal. BP. Nos données de datation indiquent donc une présence tardive de l’haplogroupe A (Trou‑du‑Renard) alors que des dates aussi tardives n’ont pour le moment pas été obtenues pour l’haplogroupe B sur la colline de Soyons, ce qui est compatible avec un remplacement d’haplogroupe.

45L’industrie lithique retrouvée jusqu’à présent dans les grottes de Châteaubourg, de Néron et du Trou‑du‑Renard a conduit à les considérer comme des sites du Paléolithique moyen. L’âge du coprolithe de Châteaubourg (39 670‑38 000 cal. BP) le situe au début du Paléolithique supérieur (Aurignacien), et ne remet pas en cause l’interprétation traditionnelle du site comme un repaire de carnivores fréquenté occasionnellement par Néandertal. Les dates obtenues pour les coprolithes de la Baume Néron et du Trou‑du‑Renard correspondent en revanche à un Paléolithique supérieur déjà bien avancé (Gravettien) et révèlent des intrusions animales
largement postérieures aux dernières occupations néandertaliennes documentées.

4.3 ‑ Analyses des génomes nucléaires d’hyène

46Westbury et al. (2020) ont montré que les relations entre les génomes nucléaires des hyènes anciennes européennes et des hyènes modernes africaines sont très différentes de celles observées entre leurs génomes mitochondriaux. Les analyses en composantes principales ont révélé en particulier que les génomes nucléaires des hyènes anciennes européennes et modernes africaines, loin de se mêler entre eux, forment deux groupes bien distincts. Nous avons reproduit ces analyses en y introduisant les données des spécimens Châteaubourg 1, Néron 2, Trou‑du‑Renard 1, Tournal 143 et Crouzade 71372 et avons confirmé les observations précédentes. La figure 8a montre en effet que l’axe CP1 différencie nettement les hyènes anciennes européennes des hyènes modernes africaines tandis que l’axe CP2 tend à séparer les hyènes anciennes selon leur position géographique, avec les hyènes d’origine est‑asiatique en haut du graphe et les hyènes d’origine européenne en bas. Les deux spécimens d’origine asiatique appartenant à l’haplogroupe mitochondrial D sont relativement éloignés des européens, qui se regroupent en fonction de leur haplogroupe mitochondrial, A ou B, en deux ensembles adjacents. Les échantillons que nous avons étudiés se retrouvent placés de façon cohérente à proximité des spécimens de même haplogroupe analysés précédemment par Westbury et al. (2020).

47Les analyses en composantes principales étaient complétées dans l’étude de Westbury et al. (2020) par un arbre phylogénétique consensus, construit à l’aide du logiciel PHYLIP à partir de 467 arbres phylogénétiques partiels correspondant à des segments de 2 Mpb non chevauchants des chromosomes nucléaires. La topologie de cet arbre consensus reflétait les résultats des analyses en composantes principales puisqu’il mettait en évidence une séparation claire entre le groupe des hyènes anciennes européennes et le groupe des hyènes africaines modernes. Cependant la topologie des arbres partiels variait fortement à l’intérieur de chacun de ces deux groupes. Nous avons reproduit cette analyse phylogénétique en y introduisant les échantillons de notre étude mentionnés précédemment et avons confirmé les observations antérieures. Ainsi, la figure 8b montre que les arbres partiels concordent en ce qui concerne les deux groupes majeurs, celui des hyènes anciennes européennes et celui des hyènes africaines modernes : 462 arbres (98,9 %) appuient l’hypothèse de la monophylie des hyènes anciennes européennes et 367 (78,5 %) soutiennent l’hypothèse de la monophylie des hyènes modernes africaines. La topologie des arbres partiels à l’intérieur de chacun de ces clades est par contre très variable. L’arbre consensus montre un regroupement préférentiel des hyènes anciennes européennes selon leur haplogroupe mitochondrial (A, B ou D), mais cette tendance est faible : en particulier les groupes des hyènes anciennes correspondant aux haplogroupes A et B n’apparaissent que dans 63 (13,5 %) et 66 (14,1 %) arbres partiels, respectivement. Comme proposé précédemment (Westbury et al., 2020), ces observations s’expliquent probablement par les flux géniques entre ces différents groupes et par des tris de lignées incomplets (incomplete lineage sorting).

5 ‑ Conclusion

48Notre étude montre la préservation de l’ADN dans les coprolithes de six sites du Sud de la France (Châteaubourg, Baume Néron, Trou‑du‑Renard, Le Figuier, La Crouzade et Tournal). Parmi les 35 espèces animales recherchées, celle dont l’ADN est systématiquement majoritaire dans les coprolithes est l’hyène des cavernes. L’ADN de différents grands mammifères est également présent dans certains coprolithes et indique la consommation par l’hyène du cheval et du bison des forêts (Baume Néron), de l’ours des cavernes (Trou‑du‑Renard), du renne (Tournal) et du rhinocéros laineux (Le Figuier). L’impossibilité d’identifier le régime alimentaire de l’hyène des cavernes à partir des autres coprolithes est attribuée à différents facteurs, tels que la consommation d’espèces autres que celles recherchées dans nos analyses, le cannibalisme de l’hyène ou encore l’ingestion de tissus pauvres en ADN. La datation des coprolithes de Châteaubourg, de la Baume Néron et du Trou‑du‑Renard les situe au Paléolithique supérieur, indiquant une dissociation entre les occupations animales et humaines des sites, où ces dernières sont documentées au Paléolithique moyen mais pas au Paléolithique supérieur. L’analyse phylogénétique des génomes mitochondriaux d’hyène reconstruits à partir de l’ADN des coprolithes révèle qu’ils proviennent en majorité de spécimens de l’haplogoupe A, qui inclut d’autres hyènes des cavernes du Pléistocène, ainsi que des spécimens actuels d’hyène tachetée d’Afrique. Avec les données de cette étude, la répartition des séquences anciennes et actuelles au sein de l’haplogroupe A apparait différente de celle proposée auparavant. L’haplogroupe B, qui ne comporte que des spécimens d’hyène des cavernes, est détecté, pour la première fois en France, à partir de l’un des échantillons (Néron). L’analyse des génomes nucléaires confirme les conclusions d’études précédentes sur les différences entre les génomes nucléaires des hyènes anciennes et modernes, ainsi que sur les indices de flux géniques et de tris de lignées incomplets entre les hyènes anciennes appartenant à différents haplogroupes mitochondriaux.