Le spectromètre de masse a été financé par l’Université de Lille, le CNRS, la Région Hauts-de-France et le Fonds européen de développement régional. Les auteurs remercient la Mission pour l’Interdisciplinarité du CNRS pour le financement du projet ProtéoMamQuat (2017- 2018) et la Région Hauts-de-France pour le financement du projet ProtéOsHdF (2021-2022). Le réseau IBiSA est remercié pour le financement de la plateforme. Les auteurs remercient les responsables de la fouille du site de Waziers pour avoir permis d’utiliser les échantillons osseux de cette étude.

1 - Introduction

1Au cours des dernières décennies, les études sur les biomolécules anciennes ont changé notre compréhension de l’évolution de la vie sur Terre. Traditionnellement, les approches paléontologiques identifient les ossements (humains et animaux) provenant de dépôts naturels ou anthropiques par la comparaison anatomique, puis permettent une étude biostratigraphique et la reconstitution des écosystèmes environnants. Ces analyses ne fournissent qu’une preuve indirecte des facteurs et des mécanismes qui ont créé la biodiversité actuelle. Les anciennes biomolécules offrent une fenêtre sur le passé biologique et nous permettent de suivre les processus évolutifs (Schroeter et al., 2022). Aujourd’hui, pour analyser ces anciennes biomolécules, un ensemble de techniques est utilisé telles que la paléogénétique (ADN ancien), les études isotopiques, la racémisation des acides aminés et, plus récemment, les techniques de protéomique. Il a été montré que les plus anciennes traces d’ADN ont été détectées à partir d’un mammouth conservé dans le pergélisol (environ 1,6 millions d’années) (Van der Valk et al., 2021) et même de l’ADN environnental au Groenland vers deux millions d’années (Kjaer et al., 2022). Toutefois, cet ADN se dégrade très vite et, en dehors de ce type de contexte exceptionnel, la limite temporelle de son utilisation est de quelques dizaines de milliers d’années. Les protéines offrent une alternative biomoléculaire dans les zones, les périodes et les tissus où l’ADN ancien ne survit généralement pas. Les protéines conservées dans les tissus minéralisés comme les os ou les dents fournissent des séquences d’acides aminés phylogénétiquement informatives, comme le montrent les analyses réalisées sur le collagène d’ossement de camélidé daté de 3,4 millions d’années découvert en Arctique (Buckley et al., 2019a) ou les protéines de dent de Gigantopithecus blacki âgé de 1,9 millions (Welker et al., 2019) ou encore des Rhinocerotidae eurasiens âgés de 1,77 millions (Cappellini et al., 2019). La protéomique est donc une méthode pertinente pour l’analyse des fossiles et devient une alternative à l’analyse de l’ADN qui est limitée par son amplification et la contamination.

2Actuellement, la paléoprotéomique utilise deux méthodes : l’approche ZooMS (Zooarcheology by Mass Spectrometry) (Buckley et al., 2009), qui permet l’identification des espèces par empreintes digitales peptidiques et une seconde méthode d’analyse plus élaborée qui est fondée sur la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS).

3La LC-MS/MS sépare d’abord les peptides d’un extrait à l’aide de la chromatographie liquide, puis applique ces peptides séparés à un système de spectrométrie de masse couplé pour des analyses robustes et rigoureuses à l’aide de la spectrométrie de masse en tandem. Les peptides en solution sont séparés en fonction de leur hydrophobicité sur une colonne en phase inverse, puis sont introduits séquentiellement dans le spectromètre de masse par ionisation par électronébulisation (ESI). Cette méthode va permettre d’obtenir la séquence en acides aminés des peptides, d’identifier et de localiser les modifications post-traductionnelles. La première analyse ESI-LC–MS/ MS a été appliquée aux restes de mammouth âgé de 43 000 ans (Cappellini et al., 2011). Depuis, la méthode a été largement appliquée à l’étude d’autres espèces éteintes telles que Castoroides ohioensis (Cleland et al., 2016), Bison latifrons (Hill et al., 2015), des oiseaux anciens (Horn et al., 2019), des reptiles (Harvey et al., 2019a,b) et des dinosaures (Schroeter et al., 2017). Le séquençage des peptides utilisé en LC MS/MS donne accès à la phylogénie et à l’histoire évolutive des espèces anciennes. Cette approche a été appliquée à l’étude des espèces endémiques d’Amérique du Sud (Welker et al., 2015), d’anciens spécimens d’Hominidés (Brown et al., 2016 ; Welker et al., 2016) et de paresseux arboricoles (Presslee et al., 2019). Actuellement, la méthode de préparation a été automatisée, la quantité d’échantillons utilisée a été diminuée jusque 5 mg et l’utilisation de banque de librairie peptidique a été employée permettant de réduire le temps des analyses (Ruether et al., 2021). Les études sur les ossements plus anciens et en particulier sur les fossiles de dinosaures sont très difficiles car elles sont entravées par la présence de contaminants. Ces études montrent l’importance de la préparation des échantillons afin d’éviter toute contamination, la nécessité du contrôlequalité de l’analyse par spectrométrie de masse et de la validation du traitement des données (Buckley et al., 2008, 2017a).

4Nous présentons ici une analyse protéomique robuste pour étudier les espèces éteintes du site Le Bas-terroir à Waziers (Nord, France) datées de la fin du Chibanien (nouvelle dénomination du Pléistocène moyen) et du début du Pléistocène supérieur (130 000 / 120 000 ans BP). La méthode a été appliquée à 15 échantillons en utilisant cinq milligrammes de matière. Dix ossements identifiés anatomiquement et cinq incertains ont été analysés. Nos analyses ont abouti à l’identification des rangs taxonomiques de chaque ossement. La conservation de la matière organique dans les ossements a permis d’identifier des modifications post traductionnelles comme des méthylations, di-méthylations, alkylations et hydroxylations sur la séquence de collagène et de localiser leur position. Cette étude montre la puissance de cette technique pour l’analyse d’ossements anciens.

2 - Matériel et méthodes

2.1- Échantillons

5Les fouilles menées à Waziers, le Bas-Terroir en 2014 et 2015 puis en 2017 ont permis la découverte de plusieurs dizaines de vestiges dentaires et osseux de vertébrés. Ce site se localise dans le département du Nord (Hérisson et al., 2022), en périphérie de l’agglomération de Douai (fig. 1). Les vestiges se répartissent dans 10 unités stratigraphiques de synthèses, US2, US3, US4, US5a à US5e, US6 et US7 (fig. 2) et couvrent trois membres litho-stratigraphiques (Deschodt et al., 2022). Le membre 1 est composé de sables et graviers (US3) surmontés par un limon gris (US4). Il est interprété comme alluvions de la fin du Saalien. Le membre 2 est composé de dépôts limono‑organique (US5a) et d’une tourbe (US5b, US5e) où s’insèrent des dépôts alluviaux limoneux clastiques (US5c, US5d). Il est interprété comme dépôt de zone humide ou de chenal dans un contexte de passage aux conditions interglaciaires eemiennes. Le membre 3 scelle et déborde largement les membres 1 et 2 qui constituent la Formation de Waziers. Il débute par des dépôts grossiers en ravines (US6) associés à une érosion et à des marqueurs de froids suivi par un dépôt fluviatile extensif de graviers de craie (US7a). US6 et US7a remanient des éléments présents dans les unités sous-jacentes eemiennes et sont attribués au glaciaire Weichselien. Le membre 3 est ensuite composé d’un dépôt fluvio-éolien lité (US7b) passant à un lœss en partie supérieure (US7c) attribué à la fin du Pléniglaciaire Weichselien.

6La méso et macrofaune découvertes au sein de la séquence de Waziers ont fait l’objet d’une analyse exhaustive et ont permis d’établir la liste des taxons présents (Auguste et al., 2022). C’est l’aurochs (Bos primigenius) qui est l’espèce la mieux représentée, suivi du chevreuil (Capreolus capreolus), du castor (Castor fiber), du cheval d’Achenheim (Equus achenheimensis), du rhinocéros de prairie (Stephanorhinus hemitoechus).

7Le cerf élaphe (Cervus elaphus), l’ours brun (Ursus arctos), le mégacéros (Megaloceros giganteus), la loutre (cf. Aonyx antiqua) et peut être le daim (cf. Dama dama) sont plus anecdotiques.

8Quinze ossements provenant du site « Le Bas-terroir » de Waziers ont été échantillonnés. Ils proviennent des fouilles 2014, 2015 et 2017 (tab. 1). La problématique de cet échantillonnage a été de tester la détermination anatomique versus l’identification protéomique, avec des pièces attribuées sans ambiguïté à un taxon (Wa-1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 15), ainsi que des pièces à détermination incertaine et nécessitant la caractérisation de l’espèce (Wa-4, 6, 9, 10, 14). Par ailleurs, deux os ont été prélevés deux fois en utilisant un protocole sensiblement différent, afin de mettre en évidence une éventuelle ou non modification des résultats suivant ce critère (Wa-3 et 13, Wa-5 et 9).

2.2 - Digestion EFASP

9La méthode de digestion des échantillons est basée sur la publication de Bray et al (2022). Les échantillons ont été digérés avec la méthode eFASP adapté de Erde et al. (2014). Avant utilisation, des filtres ultracentrifuges Amicon® de 0,5mL avec un seuil de coupure de 10 kDa (EMD Millipore, Darmstadt, Allemagne) ont été fraîchement incubés pendant une nuit avec la solution de passivation contenant 5 % (v/v) de Tween®-20 dans l’eau. Les filtres Amicon® ultracentrifuges ont été lavés quatre fois au bain-marie pendant 20 minutes. La suspension de poudre d’os et la fraction déminéralisée ont été transférées sur des filtres Amicon® séparés, 100 µL de tampon d’échange ont été ajoutés (urée 8 M, 0,2 % DCA (acide désoxycholique) p/p, bicarbonate d’ammonium 100 mM pH 8,8) puis les filtres Amicon® ont été centrifugés pendant 30 min à 10 000 g à température ambiante. Les filtrats ont été jetés puis 200 µL de tampon d’échange ont été rajoutés dans les filtres Amicon® qui ont été centrifugés. Cette étape a été répétée deux fois. Les protéines ont été alkylées pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité en utilisant 100 µL de tampon d’alkylation (urée 8 M, iodoacétamide 50 mM et bicarbonate d’ammonium 100 mM, pH 8,8). Les filtres Amicon® ont été centrifugés pendant 30 min à 10 000 g et le filtrat a été jeté. Après l’étape d’alkylation, 200 ul de tampon d’échange ont été ajoutés au filtre Amicon® qui a été centrifugé pendant 30 min à 10 000 g et le filtrat a été jeté. 200 µl de tampon de digestion (0,2 % DCA (acide désoxycholique) p/v, bicarbonate d’ammonium 50 mM pH 8,8) ont été ajoutés au filtre Amicon® puis centrifugés. Cette étape a été répétée deux fois, en jetant le filtrat à chaque étape. Les filtres Amicon® ont été transférés dans de nouveaux tubes de 2 ml. 100 µL de tampon de digestion et 40 µL de trypsine/LysC à 0,05 µg/ µL dans un tampon bicarbonate d’ammonium 50 mM pH 8,8 (Promega, Madison, USA) ont été ajoutés et incubés sous agitation dans un tube à bloc chauffant (MHR23, Hettich, Pays-Bas) pendant une nuit à 37°C. Après cette étape, les peptides présents dans le filtre Amicon® ont été récupérés dans le tube inférieur par centrifugation pendant 15 min à 10 000 g. Afin d’obtenir un maximum de peptides, les filtres Amicon® ont été lavés deux fois avec 50 µl de solution de bicarbonate d’ammonium (50 mM pH 8,8). Les filtrats contenant tous les peptides ont été transférés dans des tubes Eppendorf® de 1,5 mL. 200 µL d’acétate d’éthyle et 2,5 µL de TFA ont été ajoutés induisant l’apparition d’un précipité blanc. Aussitôt, 800 μL d’acétate d’éthyle sont à nouveau rajoutés et les tubes Eppendorf® sont centrifugés 10 min à 10 000 g. La phase organique a été éliminée. Cette étape a été répétée deux fois. Le tube Eppendorf® a été placé pendant 5 min à 60°C dans des tubes à bloc chauffant (SBH130, Stuart, Staffordshire, Royaume-Uni) pour éliminer l’acétate d’éthyle restant. Les échantillons ont été évaporés à sec à température ambiante avec un concentrateur SpeedVac™. La paroi des tubes Eppendorf® a été rincée avec 100 µl d’un mélange méthanol/eau (50/50 v/v) et de nouveau évaporée à sec. Pour l’analyse par spectrométrie de masse, l’échantillon a été dissous à nouveau dans 10 µl d’une solution aqueuse contenant 0,1 % d’acide formique. La concentration a ensuite été estimée en mesurant la DO à 215 nm en utilisant 1 µl de la solution à l’aide d’un spectromètre UV gouttelettes (DS-11+, Denovix, Wilmington, USA). Les quantités de peptides obtenues après digestion sont indiquées dans le tableau 2. Les échantillons ont été dilués à une concentration de 1 µg/µL avant analyse dans le solvant A (5 % acétonitrile et 0,1 % acide formique v/v).

2.3 - Chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem

10Les analyses LC-MS/MS ont été effectuées sur un spectromètre de masse Orbitrap Q Exactive plus couplé à un système HPLC microfluidique U3000 RSLC (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis) (Helle et al., 2019). 1 μl du mélange de peptides à une concentration de 1 µg/µL a été injecté avec le solvant A (5 % acétonitrile et 0,1 % acide formique v/v) pendant 3 min à un débit de 10 μl.min-1 sur un Acclaim PepMap100 Pré-colonne C18 (5 μm, 300 μm id × 5 mm) de ThermoFisher Scientific. Les peptides ont ensuite été séparés sur une colonne en phase inverse C18 Acclaim PepMap100 C18 (3 μm, 75 mm id × 500 mm), en utilisant un gradient linéaire (5-40 %) de la solution B (75 % acétonitrile et 0,1 % acide formique) à un débit de 250 nL.min-1 en 160 minutes puis 100 % de solution B en 5 minutes. La colonne a été lavée pendant 5 minutes avec le tampon B puis rééquilibrée avec le tampon A. La colonne et la pré-colonne ont été placées dans une étuve à une température de 45°C. La durée totale de l’analyse était de 180 min. Les analyses LC ont été acquises en mode ions positifs avec des balayages MS de m/z 350 à 1 500 dans l’analyseur de masse Orbitrap à une résolution de 70 000 à m/z 400. Le contrôle automatique du gain a été réglé sur 1 10⁶. Séquentiellement, des balayages MS/ MS ont été acquis dans la cellule de collision à haute énergie pour les 15 ions les plus intenses détectés dans les spectres MS avec une résolution de 17 500 à m/z 400 et une isolation de 1,6 m/z.

2.4 - Analyse des données

11Les données protéomiques ont été traitées avec Mascot (version 2.5.1, Matrix Science, Londres, Royaume-Uni) par rapport à la base de données NCBI (NCBIProt_20210815) limitée aux mammifères (12 254 278 séquences) et aux oiseaux (4 179 719 séquences). Les modifications ont été cherchées avec le mode « error tolerants » permettant la recherche de toutes les modifications du logiciel Mascot (1530 modifications), les coupures non spécifiques et les mutations des acides aminés. Le nombre de clivage manqués par l’enzyme est de trois, l’erreur de masse de 10 ppm pour la MS et 15 mmu pour la MS/MS. La carbamidométhylation de la cystéine a été définie comme modification fixe. L’oxydation de la méthionine et l’asparagine, la déamidation de la glutamine ont été sélectionnées comme modifications variables. Le seuil de significativité est à p < 0,01. La deuxième analyse bioinformatique a été réalisée avec PEAKS X (Bioinformatic solution INC., Waterloo, Canada) par rapport à une base de données maison contenant 1 765 séquences de collagène extraites de la base de données NCBI (All_Collagen, téléchargée en 12-2021) restreinte aux mammifères et oiseaux. La tolérance de masse du précurseur a été fixée à 10 ppm et la tolérance de masse des ions fragments à 0,05 Da. Trois clivages manqués ont été autorisés. Les mêmes modifications post-traductionnelles (PTMs) ci-dessus ont été autorisées plus l’hydroxylation des acides aminés (RYFPNKD) en tant que modifications variables. Cinq PTM variables ont été autorisés par peptides. PEAKS PTM et SPIDER fonctionnaient avec les mêmes paramètres. Les résultats ont été filtrés en utilisant les critères suivants : score protéique -10logP ≥ 20, taux de fausses découvertes de peptides (FDR) de 1 %, PTM avec Ascore = 20, intensité des ions de mutation = 5 % et Denovo ALC ≥ 50 %. Les peptides avec des substitutions d’acides aminés ont été filtrés avec une intensité minimale fixée à 1E7. Les peptides identifiés sur le collagène I alpha 1 et I alpha 2 ont été alignés sur la séquence protéique non redondante NCBI (toutes les traductions GenBank CDS non redondantes + PDB + SwissProt + PIR + PRF à l’exclusion des échantillons environnementaux des projets WGS contenant 308 570 119 séquences) pour trouver une similitude avec BLASTp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi?PAGE=Proteins). L’alignement des paramètres de notation a utilisé la matrice BLOSUM62. Les peptides spécifiques ont été validés avec un score de 100 % d’identité et une couverture complète des requêtes. Les spectres de fragmentations pour des peptides spécifiques ont été examinés manuellement pour la qualité. Les peptides identifiés ont été soumis à Unipept (version 4.0, https://unipept.ugent.be/​) pour une analyse taxonomique (Mesuere et al., 2015). L’appariement peptide-protéine est basé sur les données de la base de données UniProtKB, tandis que les taxons proviennent de la taxonomie NCBI. Les données de protéomique de spectrométrie de masse sont déposées sur le site ProteomeXchange (http:// proteomecentral.proteomexchange.org) avec l’identifiant du jeu de données PXD039657 (Vizcaíno et al., 2012; Deutsch et al., 2023) (supplément d’information 4).

3 - Résultats

3.1- Identification des protéines

12Les analyses protéomiques par LC-MS/MS ont permis d’identifier le COL1A1 (collagène 1 alpha 1) et COL1A2 (collagène 1 alpha 2) dans tous les ossements. Les résultats permettent d’identifier en moyenne 54 % +/- 3 % de la séquence du COL1A1 et 57% +/- 5% du COL1A2. Le haut pourcentage de couverture montre que le collagène présent dans les ossements est bien conservé. Le nombre de peptides identifiés est en moyenne de 525 +/- 137 pour le COL1A1 et 382 +/- 101 pour le COL1A2. Le nombre de peptides du COL1A1 et COL1A2 varie entre les échantillons car la conservation de la matière organique varie en fonction des conditions environnementales. La prévalence du collagène de type I dans ces échantillons est cohérente avec le tissu osseux, où le collagène I représente 90 % de la protéine osseuse totale (Shoulders & Raines, 2009). Cette information permet d’indiquer que l’analyse protéomique a identifié les protéines des ossements paléontologiques.

13Le tableau 2 montre les résultats des identifications par LC-MS/MS sur les échantillons. Le tableau contient le meilleur résultat d’identification pour le COL1A1 et COL1A2 avec son numéro d’accession NCBI et l’espèce identifiée. Dans le tableau 2 est indiqué, la quantité de peptide après digestion en µg, le nombre de peptides au-dessus du seuil d’identité (p<0,01), le nombre de peptides au-dessus du seuil d’homologie (p<0,01), le nombre de spectres interrogés, le score Mascot, le nombre de peptides identifiées, le nombre de séquences distinctes significatives, le nombre de séquences uniques significatives, le pourcentage de protéines de couverture sont indiqués pour chaque collagène.

14Les résultats indiquent une très bonne conservation de la matière organique au vue du nombre de peptides identifiés et de la couverture de séquence du collagène. En plus du collagène de type 1, des protéines comme la kératine, dermicine, honerine sont présentes en quantité plus faible, ce qui indique une contamination via les manipulations des ossements lors de l’excavation et de leur observation. D’autres protéines collagéniques sont présentes comme le collagène 2 alpha 1, collagène 3 alpha 1, collagène 5 alpha 2 et des protéines non collagéniques comme biglycan, prothrombin, desmoplakin.

3.2 - Identification du genre taxonomique des ossements

15Pour permettre d’attribuer des taxonomies à l’aide des peptides identifiés en LC-MS/MS, Le logiciel Unipept a été utilisé. L’ensemble des peptides identifiés par analyse protéomique a été analysé avec ce logiciel pour obtenir une classification taxonomique. Les résultats (figure 3) montrent la spécificité des peptides permettant une classification en fonction de la classe, l’ordre, la famille, le genre ou l’espèce. Les taxons ont été choisis grâce aux données d’identification de Mascot et anatomologique. L’échantillon Wa-4 à des peptides spécifiques des oiseaux, W-12 des Mustelidae, Wa-7 de Equus, Wa-10 de Elephantidae. W-3, 15, et 13 ont des peptides spécifiques pour le castor et Wa-1 et Wa-2 pour Diceros. Les échantillons Wa-5 et Wa-9 ont des peptides spécifiques pour le Bovinae et les échantillons Wa-6, 8, 14 et 11 ont des peptides spécifiques pour les Cervidae. Cette première analyse permet montrer l’attribution des peptides à des séquences protéiques avec une taxonomie associée. Les peptides permettant d’attribuer les taxonomies pour chaque échantillon sont dans le supplément d’information 1 (Hérisson et al., 2023b).

16La protéine ayant le meilleur score est le collagène de type I identifié lors de l’analyse bioinformatique avec le logiciel Mascot et celui-ci permet d’identifier la famille et le genre. L’identification des genres taxonomiques est réalisée sur la protéine avec le meilleur score et le plus grand nombre de peptides identifiés sur la séquence. Les peptides des COL1A1, COL1A2 et COL1A3 des familles et genres identifiés sont récupérés puis seuls les peptides dit uniques par le moteur de recherche Mascot sont sélectionnés. Une analyse avec le logiciel BlastP des peptides permet de comparer les peptides identifiés dans les ossements aux séquences présentes dans la base de données NCBI (National Center for Biotechnology Information) contenant 462 136 597 séquences. Cette analyse permet d’identifier les peptides spécifiques de la famille, genre et espèce. Les familles, genres et espèces identifiés par protéomique ont été mis en corrélation avec les données d’identification du paléontologue et les espèces présentes sur le site de Waziers. Ceci a permis d’affiner de ne garder que les peptides spécifiques des espèces présentes sur le site. Les résultats des analyses Blastp sont présentés dans le tableau 3. Les spectres MS/ MS des peptides spécifiques sont dans le supplément d’information 3, figures S1 à S13 (Hérisson et al., 2023b).

17Les résultats de protéomique et les identifications anatomiques réalisées par le paléontologue corrèlent dans 13 cas sur 15. L’analyse protéomique permet de lever l’incertitude sur l’identification paléontologique pour les ossements Wa-4, 6, 9, 10 et 14. L’identification LC-MS/ MS des échantillons Wa-6 et Wa-14 ne correspondent pas à celles proposées avec doute par le paléontologue.

18Des peptides spécifiques ont été trouvés pour les protéines COL1A1, COL1A2 et COL1A3. Les peptides ont permis de valider la famille ou le genre. Concernant les échantillons Wa-6, Wa-8, Wa-11 et Wa-14, un peptide spécifique de la famille des Cervidae a été identifié sur le COL3A1 sans pouvoir discriminer le genre Muntiacus ou Cervus.

19Un peptide spécifique de la famille des Rhinocerotidae a été identifiés échantillons Wa-1 et Wa-2 sur le COL1A1 sans pouvoir discriminer le genre Ceratotherium ou Diceros.

20Deux peptides spécifiques ont été identifiés sur le COL1A2 et un seul sur le COL1A1 pour l’espèce Castor canadensis pour les échantillons Wa-3, Wa-13 et Wa-15.

21Pour le genre Bos, 2 peptides spécifiques ont été identifiés sur le COL1A2 pour les échantillons Wa-5, Wa-9 sans pouvoir préciser l’espèce.

22Pour l’échantillon Wa-7, le genre Equus a été validé à l’aide d’un peptide spécifique sur le COL1A1 et 2 peptides sur le COL1A2 mais l’espèce n’a pas pu être déterminée.

23La famille Elephantidae a été validée pour l’échantillon Wa-10 avec 1 peptide spécifique sur le COL1A1 et COL1A2.

24L’échantillon Wa-12 a été identifié comme étant du genre Enhydra avec 1 peptide spécifique sur le COL1A2. L’échantillon Wa-4 a été identifié comme étant de la famille des Anatidae avec 1 peptide spécifique sur le COL1A2.

25Dans le cadre de l’analyse de l’échantillon Wa-10, le logiciel PEAKS a été utilisé pour affiner l’identification en utilisant une base de données contenant les séquences du COL1A1 et COL1A2 de la base de données NCBI et d’espèces éteintes provenant de publications. Par exemple, la séquence du collagène de Mammuthus sp. et celle de Elephas est présente dans des publications (Buckley et al., 2011, 2019b; Buckley, 2015 ; Welker et al., 2015). Le logiciel PEAKS identifie la séquence du genre Elephas avec 94% de couverture de séquence et 241 peptides pour l’échantillon Wa-10. Elephas maximus est le taxon le plus proche phylogénétiquement de Mammuthus sp. (Rogaev et al., 2006). Les séquences de COL1A1 et COL1A2 de Mammuthus sp. provenant de la publication de Welker et al., 2015 sont identifiées (séquences des COL1A1 et COL1A2 concaténées 224 peptides et 84 % de couverture de séquence) et provenant de la publication de Buckley et al. (2011) (COL1A1 57 peptides et 94 % de couverture de séquence, COL1A2 43 peptides et 95 % de couverture de séquence) mais avec de moins bons résultats car les séquences sont partielles.

26Pour les échantillons Wa-1 et Wa-2 identifiés en tant que Rhinocerotidae en protéomique et rhinocéros de prairie (Stephanorhinus hemitoechus) par les paléontologues, une comparaison avec les séquences de COL1A1 et COL1A2 du rhinocéros laineux a été effectuée (Buckley, 2015 ; Welker et al., 2017). Ces séquences ont été ajouté au logiciel PEAKS et le logiciel identifie les séquences de collagène de type de Dicerorhinus_sumatrensis avec le plus grand nombre de peptides et la meilleure couverture de séquence (COL1A1 138 peptides et 69 % de couverture de séquence, COL1A2 133 peptides et 71 % de couverture de séquence). Dicerorhinus_sumatrensis est le taxon le plus proche phylogénétiquement du genre Stephanorhinus (Welker et al., 2017). Les séquences de COL1A1 et COL1A2 de Stephanorhinus sp. (Welker et al., 2017) sont identifiées mais avec de moins bons résultats car les séquences sont partielles comme pour l’échantillon Wa-10 (COL1A1 116 peptides et 96 % de couverture de séquence, COL1A2 102 peptides et 90 % de couverture de séquence).

3.3- Identification des modifications post traductionnelles

27Nous avons détecté une variété de PTMs in vivo et diagenétiques dans ces échantillons. L’analyse des modifications post-traductionnelles telles que la déamidation de la glutamine renseigne sur l’état de conservation des os. Le peptide du COL1A1 avec la séquence GVQGPPGPAGPR a été utilisé avec et sans déamidation sur l’arginine (spectres MS/MS supplément d’information 2, figures S1 à 2, Hérisson et al., 2023b). Les échantillons plus anciens ou plus endommagés ont un niveau de déamidation plus élevé (Van Doorn et al., 2012 ; Hill et al., 2015 ; Schroeter & Cleland, 2016 ; Ramsøe et al., 2020). Les résultats indiqués dans le tableau 4 montrent une moyenne de 64,3 % de déamidation sur la glutamine et un écart type de 12,2 %, ce qui indiquerait que les échantillons sont anciens.

28Nous avons détecté différents PTMs d’origine biologique : méthylation, di-méthylation, alkylation, la carboxylation de la lysine et hydroxylation (spectres MS/ MS supplément d’information 4, figure S3 à S9, Hérisson et al., 2023b). La majorité des PTMs in vivo identifiées est l’hydroxylation de la proline. L’hydroxylation et la méthylation ont déjà été identifiées dans des études paléoprotéomiques du collagène osseux (Cappellini et al., 2012 ; Cleland et al., 2015 ; Welker et al., 2015). Ces échantillons confortent donc la présence de ces modifications dans des échantillons fossiles.

4 - Discussion

4.1- Méthodologie et identification des protéines

29Il est primordial de développer des méthodes qui permettent d’obtenir autant d’informations que possible sur les protéines présentes dans les échantillons osseux à partir d’une quantité minimale d’os (Schroeter et al., 2022). Dans nos analyses, nous avons utilisé 5 mg d’ossements pour réaliser les analyses. Pour la digestion, nous utilisons la méthode eFASP (Enhanced Filter Aided Sample Preparation) qui surpasse la digestion en solution ou FASP. Les analyses LC-MS/MS d’os paléontologiques digérés par eFASP optimisé offrent un nombre plus élevé de peptides identifiés, un pourcentage de couverture plus élevé et l’identification fiable des PTM car très peu de fausses modifications sont induites par la digestion eFASP (Erde et al., 2014). L’utilisation de filtre Amicon® avec un seuil de coupure de 10kDa permet d’éliminer les sels, détergents utilisés lors de la préparation des échantillons. Lors du vieillissement des ossements, les protéines sont dégradées et des peptides sont générés permettant d’obtenir des informations sur la conservation (Ntasi et al., 2022). Les peptides générés lors la dégradation des protéines dans les ossements sont éliminés lors des lavages dans notre méthode. Les interrogations avec le moteur de recherche Mascot sont uniquement réalisées avec la trypsine comme enzyme et le mode semi-tryptique n’est pas utilisé.

30La préservation osseuse et la présence de contaminants modernes sont deux difficultés majeures dans les études de paléoprotéomiques osseuses. Dans notre étude, les kératines, l’honérine humaine et la dermicine, très souvent décrites comme des contaminants dans les analyses protéomiques des os, ont été détectées à l’état de traces (Wadsworth & Buckley, 2014; Sawafuji et al., 2017). Afin de confirmer la présence de protéines anciennes, plusieurs contrôles ont été réalisés au niveau paléontologique et protéomique. Les ossements ont été prélevés dans un niveau géologique bien caractérisé correspondant à la fin du Saalien et à l’Eemien (entre 130 000 et 110 000 ans) et ces restes osseux ont été déterminés de manière traditionnelle par anatomie comparée avec les espèces actuelles analogues ou proches. Le prélèvement pour les analyses protéomique a été réalisé sur ces ossements préalablement nettoyés, avec des gants, sous une sorbonne. L’article de Hendy et al. (2018) explique les différentes étapes et vérifications lors des analyses en paléoprotéomique. Pour vérifier la présence de protéines anciennes, la valeur de déamidation sur le COL1A1 a été mesurée. Celle-ci varie entre 50 et 74 % ce qui permet d’indiquer qu’il s’agit de protéine ancienne (Schroeter et al., 2022 ; Warinner et al., 2022).

31Les deux chaînes de collagène de type I, représentant 90 % de la matière organique osseuse, ont été identifiées avec jusqu’à 60 % de couverture sur les deux chaînes. Ce résultat montre une préservation osseuse exceptionnelle. L’analyse protéomique basée sur le protocole eFASP sans extraction de protéines après déminéralisation à partir de seulement 5 mg de matière première permet d’identifier un grand nombre de peptide et d’obtenir une grande couverture de séquence. On peut souligner que des matières premières allant de 30 mg à plusieurs centaines de mg sont couramment décrites dans les études paléoprotéomiques (Cappellini et al., 2011 ; Buckley et al., 2017b, c ; Welker et al., 2017). Les progrès de l’instrumentation en spectrométrie de masse permettent de diminuer les quantités d’ossements jusque 5 mg comme le montrent les publications actuelles (Ruether et al., 2021 ; Bray et al., 2022). L’analyse en mode « Data Dependent Acquisition » est utilisée dans notre article. Cette méthode consiste à acquérir un spectre MS et les ions majoritaires sont successivement sélectionnés et fragmentés en MS/MS. Cette méthode peut être remplacée par l’analyse « Data Indepentdent Acquisition ». Cette méthode d’acquisition consiste à sélectionner les ions d’une plage de masse et fragmenter tous les ions. Cette méthode permet de réduire le temps des analyses et d’utiliser des librairies de spectre comme dans l’article de Ruether et al. (2021). Il faut noter que les nouveaux spectromètres de masses pourraient permettre de diminuer les quantités, d’identifier davantage de peptides et de diminuer les temps d’analyses.

32D’autres collagènes ont été identifiés comme COL2A1, un collagène fibrillaire trouvé dans le cartilage, COL3A1, un composant structurel majeur dans les organes creux, et COL5A2, un composant mineur du tissu conjonctif (Shoulders & Raines, 2009). Welker et ses collègues ont montré la présence d’autres types de collagène, comme COL10A1 et COL27A1, dans des spécimens osseux de la Grotte du Renne (Welker et al., 2016). Des protéines non collagéniques (NCP) ont été détectées comme biglycan, prothrombin, desmoplakin et ont été décrites dans plusieurs études sur des os anciens (Cappellini et al., 2011 ; Wadsworth & Buckley, 2014 ; Sawafuji et al., 2017).

4.2 - Identification du genre

33Les identifications ont été réalisées en utilisant la base de données NCBI. Cette base de données contient les séquences de collagène des espèces modernes dont le génome a été annoté. Il existe très peu de génomes annotés d’espèce éteinte comme celui de Mammut americanum (Rohland et al., 2010). Les identifications des espèces données correspondent aux homologues actuels les plus proches. L’identification des espèces a été réalisé en identifiant des peptides spécifiques ce qui signifie que la séquence du collagène est unique parmi toutes les séquences de protéines de NCBI (224 211 842 séquences de protéine provenant de 117 030 organismes).

34L’analyse avec MASCOT permet de faire une identification de la famille, du genre en utilisant le collagène de type I avec une limitation qui est les séquences protéiques présentes dans la base de données. Dans notre article, l’identification des ossements est corrélée avec les informations morphologiques proposées par le paléontologue. Cette corrélation permet d’affiner les identifications en protéomique et de valider les espèces identifiées. Lorsque les analyses protéomiques sont réalisées sur des fragments d’ossements, les informations morphologiques ne sont pas disponibles. Dans ce cas, une analyse avec la méthode ZooMS dans un premier temps permet d’identifier rapidement la famille à l’aide de peptides marqueurs. Une analyse LC-MS/MS peut ensuite être réalisée pour obtenir des informations plus précises comme les protéines, les séquences des protéines, les PTMs. Dans les échantillons d’ossements d’autres protéines sont présentes et pourraient permettre l’identification de la famille, du genre, de l’espèce. (Schroeter et al., 2022 ; Warinner et al., 2022)

35L’utilisation de PEAKS et une base de données contenant des séquences de publications permet d’affiner les identifications. Il est important de noter que les séquences des publications ne sont pas complètes et des trous dans les séquences protéiques sont présents. Lors des analyses protéomiques, il est primordial de travailler avec des bases de données contenant le maximum de séquences de collagène provenant des bases de données NCBI, Swissprot et des publications. Par ailleurs, cette étude montre également l’importance des données protéomiques avec les études paléontologiques et de travailler sur les séquences protéiques des espèces les plus proches.

36L’échantillon Wa-3 (et Wa-13) a été identifié sur la base de données NCBI en tant que Castor canadensis avec une couverture de séquence de plus de 50 % ce qui est plus élevé que l’étude réalisée par Timothy P. Cleland sur Castoroides ohioensis âgé de 10 150 ± 50 ans BP (Cleland et al., 2016). Ceci indique que la méthode utilisée est plus sensible et que les ossements sont très bien conservés.

37L’analyse LC-MS/MS de l’échantillon Wa-6 ne donne pas une identification en corrélation avec celle réalisée par le paléontologue. Cet os a été identifié en tant que Cervus en protéomique et en tant que bovidé, probablement l’aurochs, par le paléontologue. Cette différence est due à une identification incertaine liée à l’absence d’éléments diagnostiques permettant une détermination sur des critères ostéomorphologiques. La protéomique permet ainsi d’aider les paléontologues dans leur démarche d’identification des taxons.

4.3 - Identification des PTMs

38Dans cette étude, le pourcentage de déamidation varie entre 50 et 74 % sur le COL1A1 dans tous les échantillons, ce qui correspond au pourcentage de déamidation décrit dans la littérature (Welker et al., 2017). Il a été montré que la déamidation de glutamine est plus stable que la déamidation de l’asparagine et que la demi-vie de la déamidation de l’asparagine sur l’échelle de temps physiologique est plus courte que la déamidation de la glutamine (Robinson et al., 2004 ; Li et al., 2010). De nombreuses études sur les os anciens ont étudié le taux de déamidation ce qui permet une comparaison. Des pourcentages de déamidation de la glutamine et de l’asparagine d’environ 50 % et 60 % respectivement ont été trouvés pour des os de 40 000 et 50 000 ans BP de Kleine Feldhofer Grotte (Allemagne) (Lanigan et al., 2020). L’analyse de la déamidation de l’assemblage de 475 ossements de Quinçay, datant du Châtelperronien (Pléistocène supérieur, 44 500-36 000 ans BP) et de l’Holocène ancien a montré un taux moyen de déamidation de 60 %. Sur des spécimens osseux du Chibanien du rhinocéros du genre Stephanorhinus (337 000-300 000 ans BP), les déamidations de la glutamine et de l’asparagine atteignent près de 100 % (Welker et al., 2017). Des recherches récentes montrent un taux de déamidation variable au sein d’un même assemblage osseux sur 45 000-50 000 ans BP jusqu’à 305 000-284 000 ans BP (Brown et al., 2021). Ces études mettent en évidence la difficulté d’utiliser le taux de déamidation pour dater relativement les échantillons. Les différences de taux de déamidation entre les publications pour les os de la même période peuvent s’expliquer par les différentes procédures d’extraction des protéines pour la déminéralisation et/ou des protéines uniques qui induisent une déamidation variable (Ren et al., 2009 ; Hao et al., 2011 ; Van Doorn et al., 2012; Wilson et al., 2012 ; Simpson et al., 2016). Le contexte sédimentaire et les conditions environnementales peuvent également influencer le pourcentage de déamidation (Schroeter & Cleland, 2016). La préservation des protéines osseuses peut être déduite à la fois du pourcentage en poids de collagène extrait des os et du taux de déamidation qui a été rapporté comme marqueur de dégradation dans les os anciens (Van Doorn et al., 2012).

39La détermination de l’endogénéité des protéines fossiles et des PTM biologiques est essentielle pour évaluer leur fonction biologique. Les PTMs identifiées dans cet article, ont pu être observées dans l’article de Timothy Cleland et al. (2015).

40De nombreuses publications identifient des prolines hydroxylées sur les peptides dans des échantillons anciens. Cette modification est impliquée dans la stabilisation de la triple hélice du collagène (Kotch et al., 2008). Nos analyses ne détectent pas de modification comme l’oxydation des tryptophanes ou la formation d’acide aminoadipique à partir de lysine qui ont été décrit dans des ossements anciens (Cappellini et al., 2011 ; Cleland et al., 2015). Des oxydations des lysines ont été observées. Cette modification est observée lors du vieillissement ou lors de dégradation (Reeg & Grune, 2015). Des méthylations des lysines ont été détectées et sont identifiées chez les eucaryotes ce qui indique une endogénéité de ces modifications (Sprung et al., 2008). De nombreuses modifications présentes sur les ossements sont dues à l’effet des conditions environnementales mais certaines comme l’hydroxyproline ou la méthylation sont des modifications in vivo. Ceci montre que la protéomique peut permettre d’identifier des modifications spécifiques des organismes et des modifications dues aux conditions de conservation.

5 - Conclusion

41Notre étude a démontré la possibilité d’identifier des taxons d’os d’au moins 130 000 ans en utilisant une méthode de protéomique optimisée à partir d’échantillons de 5 mg. Un grand nombre de peptides a été identifié avec des couvertures de séquences moyennes élevées allant jusqu’à 60 % pour le collagène I alpha 1. Malgré les bases de données restreintes pour plusieurs espèces, plusieurs taxons ont été identifiés. La protéomique a permis d’identifier sans équivoque le rang générique de tous les ossements et d’arriver à l’espèce pour la majorité des ossements. C’est une contribution majeure en particulier pour les études paléontologiques et archéozoologiques souvent aux prises avec l’identification impossible des espèces, de par l’absence de caractères diagnostiques sur les ossements, l’altération des os, la taille des ossements ainsi que les modifications de forme liées aux activités anthropiques (os brûlés, outils en os, supports artistiques, etc.).