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Análisis genético-poblacional del yacimiento neolítico de Tell Ramad, Siria

Eva Fernández, Eduardo Arroyo, Alejandro Pérez-Pérez et Daniel Turbón
p. 107-113

Résumés

Le phénomène de diffusion du Néolithique depuis le Proche-Orient vers l’Europe et son influence sur la néolithisation de l’Europe a été abordé par diverses disciplines. L’analyse génétique des populations humaines récentes a donné des résultats contradictoires. Tandis que la distribution et les fréquences allele des «  marqueurs classiques » (groupes sanguins et protéines), et la variabilité moléculaire du chromosome Y confortent le modèle de diffusion démique, la variabilité de l’ADN mitochondrie nous propose une origine surtout paléolithique des populations européennes actuelles, avec une petite contribution néolithique depuis le Proche-Orient.
L’analyse génétique des échantillons biologiques nous permet d’établir cette hypothèse. Dans ce travail, nous avons étudié la variabilité mitochondrial de sept individus du néolithique PPNB de Tell Ramad (Syrie). Les séquences d’ADN mitochondrial obtenues sont très similaires à celles trouvées aujourd’hui en Europe et au Proche-Orient, et elles suggèrent que, dans cette région, il y aurait une continuité génétique depuis le Néolithique.

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Texte intégral

Introducción

1El fenómeno de difusión del neolítico desde Oriente Próximo hacia Europa y su impacto sobre la neolitización de Europa ha sido abordado desde diversas disciplinas. En el campo de la genética de poblaciones, se han analizado diversos marcadores moleculares, esencialmente de tres tipos : marcadores clásicos, DNA mitocondrial y cromosoma Y.

  • 1 Menozzi et alii 1978; Cavalli-Sforza et alii 1993; Cavalli-Sforza et alii 1994; Piazza et alii 1995 (...)

2La distribución y frecuencias alélicas de ciertos marcadores nucleares, como los grupos sanguíneos y las proteínas plasmáticas, así como la variación molecular del cromosoma Y sitúan el origen de la composición genética de la Europa actual en las primeras poblaciones neolíticas del creciente fértil 1. Según estos autores el crecimiento demográfico propiciado por el desarrollo de una nueva economía de producción, impulsó a las primeras poblaciones neolíticas del Próximo Oriente a la colonización de nuevos territorios de Occidente, generando una “ola de avance” que llegaría hasta la Península Ibérica.

  • 2 Richards et alii 2000.

3Por el contrario, el análisis del DNA mitocondrial de las poblaciones europeas actuales sugiere que la mayor parte de la variabilidad mitocondrial observada hoy en día tiene su origen en el Paleolítico Superior, siendo la contribución neolítica inferior al 23 % 2. Esta última suposición se basa esencialmente en el cálculo de la variabilidad (medida como diferencias genéticas entre linajes de DNA mitocondrial) dentro de cada haplogrupo mitocondrial y en la estima del tiempo necesario para la generación de dicha variabilidad asumiendo que la mutación es la única fuente de variabilidad.

  • 3 Semino et alii 1996, 2000; Rosser et alii 2000.

4La distribución de frecuencias de algunos polimorfismos de la región no recombinante del cromosoma Y (NRY) muestra un gradiente sureste-noroeste muy similar al mapa sintético de la primera componente principal de los estudios realizados con marcadores clásicos, que ha sido interpretada como la huella genética de la expansión neolítica 3.

5Llegados a este punto, los estudios de DNA antiguo disponen del potencial para testar la validez de algunos de los mencionados supuestos. El estudio de muestras de época neolítica supone un interesante punto de partida, puesto que el número de muestras disponibles de esta época es mucho mayor que el de épocas anteriores como consecuencia de la sedentarización de las poblaciones. Esto facilita la labor de los estudios de DNA antiguo, puesto que no hay que olvidar el carácter destructivo de la técnica de análisis.

Material y método

6Se seleccionaron para su estudio 18 muestras pertenecientes a 13 individuos del yacimiento neolítico de Tell Ramad (Siria), de las cuales 15 eran piezas dentales y el resto fragmentos de hueso largo. La información de estas muestras se resume en la tabla 1.

7Las muestras se limpiaron en superficie mediante óxido de aluminio a presión con una “arenadora” (Sand-blaster) Dentalfarm, modelo Base 1 Plus, con el fin de eliminar la capa más externa, y con ella parte de la suciedad procedente del enterramiento y posibles moléculas de DNA contaminante. Una vez realizada la limpieza, las muestras se irradiaron con luz ultravioleta (UV) durante 30 minutos en el interior de una campana de flujo laminar. Las muestras limpias fueron trituradas en un molino de impactación electromagnética refrigerado con nitrógeno líquido.

8El polvo de hueso o diente resultante de la trituración se lavó varias veces con EDTA 0.5M para eliminar el calcio, incubándose a continuación toda la noche en solución de lisis con proteinasa K, para digerir las proteínas y liberar el DNA.

9La extracción del DNA total se realizó mediante un protocolo estándar Fenol/Cloroformo. El producto final se concentró con micro-concentradores Centriplus-30000 (Millipore).

Criterios de autenticidad

10Para garantizar la autenticidad de los resultados obtenidos, se aplicaron la mayoría de los criterios de autenticidad clásicos para DNA antiguo :

  1. Análisis en un laboratorio exclusivo para DNA antiguo.

  2. Separación física de los procesos pre-PCR y post-PCR.

  3. Empleo de material exclusivo para el análisis de DNA antiguo.

  4. Eliminación de la capa superficial de la muestra.

  5. Análisis por un único investigador.

  6. Empleo de controles o blancos de extracción y de amplificación, que contienen todos los reactivos excepto la muestra. Cualquier resultado positivo en estos blancos se considera indicativo de la contaminación de la muestras con DNA exógeno.

  7. Realización de diversas amplificaciones de un mismo extracto o de diferentes extractos de un mismo individuo. En el presente trabajo se realizaron extracciones a partir de dos o más muestras de un mismo individuo en 4 casos : R65-8, R65-10, R65-4II y R69-2 (ver tabla 1).

  8. Comparación de las secuencias obtenidas con el personal de laboratorio y con el personal arqueológico y/o antropológico que alguna vez tuvo contacto con la muestra.

  9. Observación de una correlación inversa entre la longitud del fragmento amplificado y la eficiencia de amplificación.

  10. Asesoramiento del estado de preservación macromolecular del resto mediante el análisis de otras biomoléculas. Concretamente, se estimó la ratio entre las isoformas D y L (D/L) del ácido aspártico (Asp) en tres muestras : TR9, TR11 y TR16.

  11. Clonación molecular de los productos de amplificación y secuenciación de múltiples clones. Pudieron clonarse y secuenciarse dos productos de amplificación de las muestras TR12, TR14 y TR19, con resultado consistente con la secuencia directa recuperada.

  12. Cuantificación del número de moléculas de DNA presente en los extractos. Si el número de moléculas en los extractos es inferior al millar, existe una elevada probabilidad de que la PCR copie aquellas cadenas alteradas químicamente, dando lugar a resultados no reproducibles. Se pudieron cuantificar todos los extractos obtenidos de las muestras de Tell Ramad empleando un diseño específico para Real Time PCR. El resultado en todos los casos fue un número de moléculas de DNA en todos los extractos superior a la décima de millar. Este resultado excluye la posibilidad de reproducción en las secuencias obtenidas del mencionado “daño molecular” de las cadenas originales.

Amplificación del DNA mitocondrial

11La región objeto de estudio corresponde a un fragmento de 244 pares de bases editadas de la Región Hipervariable I (HVSI) del DNA mitocondrial (posiciones 16126-16369). Esta región fue seleccionada y copiada en dos amplificaciones solapantes mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) usando cebadores específicos que proporcionaban dos productos de amplificación de 133 y 112 pares de bases (p.b.).

  • 4 Anderson et alii 1981.

12Los productos de amplificación se secuenciaron en un secuenciador automático (ABI-PRISM 3700). Las secuencias así obtenidas se compararon con la secuencia consenso de Cambridge (CRS)4, la más común entre la población europea.

Resultados y discusión

13Se obtuvieron secuencias de DNA mitocondrial de 8 muestras pertenecientes a 7 individuos del yacimiento neolítico de Tell Ramad, lo que supone un 44.4 % de eficiencia. En 6 casos pudo obtenerse una secuencia completa de 244 p.b., mientras que en dos tan sólo pudo recuperarse uno de los dos fragmentos de DNA mitocondrial estudiados.

Relaciones de parentesco

14De las 6 secuencias completas recuperadas, tan sólo dos son compartidas entre los individuos TR16 y TR18, siendo las restantes únicas dentro del yacimiento.

15La coincidencia de los linajes de DNA mitocondrial de estos dos individuos puede explicarse mediante las relaciones de parentesco por vía materna, o por azar.

  • 5 Fernández 2005.

16Que se trate de una u otra explicación dependerá de la frecuencia del linaje en cuestión en la población estudiada. Ya que se desconoce la composición genética de las poblaciones neolíticas, y concretamente, de la población de Tell Ramad, pueden utilizarse como referencia las poblaciones actuales de Europa y Próximo Oriente. La secuencia de DNA mitocondrial compartida por las muestras TR16 y TR18 de Tell Ramad, se encuentra actualmente en 3 individuos de una base de datos de 2020 secuencias de DNA mitocondrial de Europa y Próximo Oriente 5.

17Para calcular la probabilidad de que los individuos TR16 y TR18 estén emparentados podemos asumir, por tanto, que la frecuencia de su haplotipo (secuencia de DNA) es de 0.001485. Esto significa que la probabilidad de que ambos fueran idénticos por azar, suponiendo que la distribución de frecuencias del pasado pueda equipararse a la actual, es menor que (0.001485)2, lo que equivale a menos de 2.205 x 10-6. Esta probabilidad es lo suficientemente pequeña como para apoyar la hipótesis de que los individuos TR16 y TR18 están relacionados genéticamente por vía materna. En términos probabilísticos, puede decirse que la probabilidad de que dichos sujetos hubieran sido muestreados aleatoriamente de una población donde la frecuencia de su haplotipo fuera menor a 0.001485, es 2.205x10-6. Si el problema se planteara a modo de caso forense sería :

18P (identidad de las 2 muestras condicionada a su igualdad por descendencia)

19P (identidad de las 2 muestras condicionada a su identidad por azar)

20Dado que la probabilidad de que dos individuos iguales por descendencia materna compartan el mismo DNA mitocondrial es igual a 1, la relación sería 1/2.205x10-6, que equivale a 453468. Si la probabilidad de parentesco se calcula como  :

21entonces 453468/453469 =0.999997794 (99.9997794 %). Este valor, en caso de tratarse de una peritación forense, sería considerado concluyente.

22Este tipo de peritaciones se realizan con marcadores de DNA nuclear autosómicos, heredados del padre y de la madre y con gran poder discriminador. Sin embargo, el DNA mitocondrial es un marcador de linaje, no de individuo, que hace indistinguible a toda la línea materna, de manera que, por ejemplo, los hermanos y los primos maternos de primer grado son indiferenciables. Teniendo esto en cuenta, otros grados de parentesco matrilineal, dejando al margen a los hermanos maternos, podrían ser igualmente considerados.

23Cabe también la posibilidad de que la identidad mitocondrial de los grupos de individuos considerados se deba a una elevada frecuencia de las secuencias observadas – superior a la actual – en la población a la que pertenecen. Esto no implicaría una relación de parentesco próximo pero podría implicar un parentesco en un grado muy lejano.

Implicaciones poblacionales

24Algunas de las variante mitocondriales (haplotipos) encontradas en Tell Ramad se encuentran hoy en día en las poblaciones Europeas y de Próximo Oriente. Este es el caso del haplotipo de la muestra TR12, presente en la mayor parte de dichas poblaciones. El haplotipo compartido entre las muestras TR16 y TR18 se encuentra hoy en día – según nuestra base de datos de secuencias de DNA mitocondrial –exclusivamente en una población de origen druso. Se trata, por lo tanto, de una variante rara y exclusiva de Próximo Oriente. Teniendo en cuenta la baja frecuencia de dicha variante en el resto de poblaciones, puede decirse que muy probablemente existe una relación por vía materna entre el grupo druso actual y los antiguos pobladores de Tell Ramad. Este hecho demuestra que, aunque con el transcurso del tiempo existe una tendencia a la pérdida de linajes genéticos, en algunos casos como en el que nos ocupa, puede rastrearse una variante en el tiempo hasta hace 10000 años atrás.

25Los tres haplotipos restantes, correspondientes a las muestras TR8, TR14 y TR19, no se encuentran representados hoy en día en las bases de datos consultadas. Sin embargo, a pesar de no estar presentes actualmente, estas variantes se relacionan de una forma muy próxima con otras que sí que existen hoy en día.

26Las secuencias recuperadas pertenecen a haplogrupos típicamente europeos y de Próximo Oriente (H y K), a excepción de la muestra TR19, que puede incluirse en el haplogrupo C, característico de poblaciones asiáticas y/o americanas nativas.

  • 6 Haak et alii 2005.
  • 7 Haak et alii 2005.

27Ninguno de los haplotipos recuperados puede adscribirse al haplogrupo N1a, encontrado en elevada frecuencia en individuos de yacimientos neolíticos de 7500 años de antigüedad de Alemania y Austria, pertenecientes a la cultura cerámica LBK/AVK 6. Esta variante mitocondrial ha sido propuesta como característica de las poblaciones neolíticas de Próximo Oriente. Según Haak 7, la baja frecuencia en que se encuentra este haplotipo en la actualidad es indicativa de que la difusión del Neolítico en Europa fue un fenómeno predominantemente cultural. La ausencia de esta variante en el yacimiento de Tell Ramad, contradice la hipótesis de Haak. Puesto que todos los haplotipos de las muestras de este yacimiento – a excepción de TR19 –, pertenecen a haplogrupos europeos, sería lógico suponer que fueran estas variantes las que, de haberse producido una expansión démica de estas poblaciones, habrían sido llevadas a Europa. La presencia de variantes típicamente europeas en los yacimientos de Alemania y Austria analizadas por Haak apoya esta hipótesis. Dado que el número de muestras neolíticas de Próximo Oriente analizadas hasta el momento es reducido, conviene ser cautelosos con las interpretaciones realizadas. Sin embargo, la posibilidad de recuperar información genética a partir de muestras de regiones cálidas – y en principio poco óptimas para la preservación del DNA – y de tal antigüedad ofrece un interesante punto de partida para la realización de estudios futuros.

Tabla 1

Tabla 1

Muestras de Tell Ramad estudiadas y resultados obtenidos.

Este trabajo no hubiera sido posible sin la ayuda de Josep Anfruns y del Dr. Prof. Miquel Molist, de la Universidad Autónoma de Barcelona, que han proporcionado las muestras y una inestimable infomación arqueológica.

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Bibliographie

Anderson (S.), A. T. Bankier, B. G. Barrell, M. H. L. Bruijn, A. R. Coulson, J. Drouin, L. C. Eperon, D. P. Nierlich, B. A. Roe, F. Sanger, P. H. Schreier, A. J. H. Smith, R. Staden & L. G. Young 1981 “Sequence and Organization of the Human Mitochondrial Genome”, Nature, 290, p. 457‑464.

Cavalli-Sforza (L. L.), P. Menozzi & A. Piazza 1993 “Demic Expansions and Human Evolution”, Science, 259, p. 639-646.

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Fernández (E.) 2005 Polimorfismos de DNA mitocondrial en poblaciones antiguas de la cuenca mediter-ránea, Tesis Doctoral, Universidad de Barcelona.

Haak (W.), P. Forster, B. Bramanti, S. Matsumura, G. Brandt, M. Tanzer, R. Villems, C. Renfrew, D. Gronenborn, K. W. Alt & J. Burger 2005 “Ancient DNA from the first European Farmers in 7500-year-old Neolithic Sites”, Science, 1, 310 (5750), p. 1016-1018.

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Richards (M.) et 36 alii 2000 “Tracing European Founder Lineages in the Near Eastern mtDNA Pool”, American Journal of Human Genetics, 67 (5), p. 1251-1276.

Rosser (Z.H.) et 62 alii 2000 “ Y-chromosomal Diversity in Europe is clinal and influenced primarily by geography, rather than by language”, American Journal of Human Genetics, 67(6), p. 1526-1543.

Semino (O.), G. Passarino, A. Brega, M. Fellous & A.S.  Santachiara-Benerecetti 1996 “A View of the Neolithic Demic Diffusion in Europe through two Y chromosome-specific Markers”, American Journal of Human Genetics, 59(4), p. 964-968.

Semino (O.) et 16 alii 2000 “ The Genetic Legacy of Paleolithic Homo sapiens sapiens in Extant Europeans : a Y Chromosome Perspective”, Science, 290(5494), p. 1155-1159.

Bases de datos consultadas

mtDB-Human Mitochondrial Genome Database : http://www.genpat.uu.se/mtDB/

Ingman (M.), Molecular Anthropology, Section of Medical Genetics, Department of Genetics and Pathology, Uppsala University, Sweden.

mtDNA Population database (FBI) : http://www.fbi.gov/hq/lab/fsc/backissu/april2002/miller1.htm#Introduction

Monson (K. L.), Miller (K. W. P.), Wilson (M. R.), Dizinno (J. A.), Budowle (B.), The mtDNA Population Database : An Integrated Software and Database Resource for Forensic Comparison, Forensic Science Communications 4(2).

Para más información sobre DNA antiguo y otras cuestiones, recomendamos consulten nuestra página web : http://www.ucm.es/info/genforen/

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Notes

1 Menozzi et alii 1978; Cavalli-Sforza et alii 1993; Cavalli-Sforza et alii 1994; Piazza et alii 1995; Semino et alii 1996.

2 Richards et alii 2000.

3 Semino et alii 1996, 2000; Rosser et alii 2000.

4 Anderson et alii 1981.

5 Fernández 2005.

6 Haak et alii 2005.

7 Haak et alii 2005.

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Table des illustrations

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Titre Tabla 1
Légende Muestras de Tell Ramad estudiadas y resultados obtenidos.
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Pour citer cet article

Référence papier

Eva Fernández, Eduardo Arroyo, Alejandro Pérez-Pérez et Daniel Turbón, « Análisis genético-poblacional del yacimiento neolítico de Tell Ramad, Siria », Syria, 83 | 2006, 107-113.

Référence électronique

Eva Fernández, Eduardo Arroyo, Alejandro Pérez-Pérez et Daniel Turbón, « Análisis genético-poblacional del yacimiento neolítico de Tell Ramad, Siria », Syria [En ligne], 83 | 2006, mis en ligne le 01 juillet 2016, consulté le 28 novembre 2020. URL : http://journals.openedition.org/syria/176 ; DOI : https://doi.org/10.4000/syria.176

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Auteurs

Eva Fernández

Departamento de Toxicología y Legislación Sanitaria
Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid

Eduardo Arroyo

Departamento de Toxicología y Legislación Sanitaria
Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid

Alejandro Pérez-Pérez

Unidad de Antropología, Departamento de Biología Animal
Facultad de Biología, Universidad de Barcelona

Daniel Turbón

Unidad de Antropología, Departamento de Biología Animal
Facultad de Biología, Universidad de Barcelona

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Droits d’auteur

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